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肺癌是我国发病率和死亡率第一的癌症。研究发现,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在亚洲肺癌患者的突变率为40%,KRAS的突变率为10%。然而进行组织切片来持续监测疾病的进展极具挑战性,因此需要开发出一种微创或无创的检测方法。液体活检是一个很好的诊断方法,可用于非侵入性的监测疾病进展,血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)主要是存在于血液、滑膜液等体液中,cfDNA的分析是临床医师选择靶向治疗的一个基本工具,且正在成为一个判断预后的强大的监测方法。为了通过捕获和分析血浆游离DNA评估癌症疾病的变化,许多高度敏感和特异的技术已经开发出来。微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,DDPCR)是定量检测的一个敏感的方法,只需极少量的样本即可检测,该方法不必参照标准品或内源性对照,高灵敏度和所需样本量少,大大满足了临床珍贵样本如穿刺样本、胸腹水、外周血中靶标序列的微量检测的需求。目的:在此背景下,本研究旨在开发基于数字PCR平台的血浆游离DNA突变基因检测技术,用于肺癌微创检测。通过采集病人血浆样本,检测某些与癌症密切相关的基因EGFR、KRAS突变情况。方法:本研究通过微滴式数字PCR技术,针对肺癌EGFR(E18/19/20/21四个外显子)及KRAS基因共五个位点的37个突变进行特殊的引物和探针设计,以细胞系DNA和阳性标准品为样本进行测试和优化,从而确定反应体系,最终建立对游离DNA中EGFR18/19/20/21及KRAS突变位点的检测方法,最后对351例临床样本进行验证,并比较其与二代测序的一致性。结果:1、以细胞系DNA和阳性标准品为样本进行引物和探针的测试和优化,成功确立了DDPCR法检测血浆DNA中EGFR及KRAS突变位点的反应体系;2、依据文中建立的体系对已合成的阳性质控品进行检测,证明最低检测限可以达到0.04%,通过对商业标准品的检测判断其检测的准确性可以达到100%;3、将二代测序作为金标准,依据已建立的反应体系,通过微滴式数字PCR检测351例肺癌病人cfDNA样本,结果显示E18E19E20E21及KRAS灵敏度分别可以达到100%,96%,97%,100%,93%;与二代测序的一致性可以达到96%以上;结论:本文建立了对游离DNA中EGFR及KRAS突变位点的检测方法,成功开发了一个基于数字PCR平台的血浆游离DNA突变基因检测技术,并证明微滴式数字PCR检测血浆游离DNA的具有很高的特异性和灵敏性。此法提供了一个无创、快捷且绝对定量的动态监测肺癌患者EGFR及KRAS基因突变的方法。该技术不仅可以监测EGFR及KRAS敏感突变的突变率变化,还可以及时检测耐药突变的出现,对肺癌的治疗和预后具有重要的指导意义。