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目的 制备重组CFP-10蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断和皮试诊断中的应用价值。 方法 PCR扩增得到CFP-10、CFP10-ESAT6基因片断,将其分别克隆入pET-24b和pET-28a表达载体。优化表达条件、纯化重组CFP-10蛋白(rCFP-10)和CFP10-ESAT6蛋白(rCFP10-ESAT6)。建立以rCFP-10、rESAT-6、rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测结核患者血清和健康者血清中的抗体。建立豚鼠13种分枝杆菌致敏模型,PPD及三种重组蛋白皮肤轮圈试验,注射后24h、48h、72h测量DTH反应纵、横直径(cm)。 结果 重组质粒pET24b-CFP10、pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。两种重组蛋白在Ecoli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量分别占菌体总蛋白的20%和40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到90%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。ELISA结果显示:rCFP-10的特异性和敏感度分别为100%和15.1%:rESAT-6分别为97%、18.2%;rCFP10-ESAT6分别为97%、36.4%。三种重组蛋白均可诱发H37Rv致敏豚鼠的DTH反应,其效力与PPD相似。在卡介苗(BCG)及其他多种分枝杆菌致敏豚鼠体内,诱发DTH反应的能力小于PPD,差别有显著性意义(P<0.05)。 结论 pET24b-CFP10/BL21(DE3)、pET28a-CFP10-ESAT6/BL21(DE3)工程菌能高效表达CFP-10蛋白和CFP10-ESAT6融合蛋白,该重组蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原。