论文部分内容阅读
活性氧自由基是生物体内产生的信号分子,具有重要的生理功能,但当机体内的活性氧过量时,会引发机体发生氧化应激反应。合理补充抗氧化物质对有效缓解氧化应激、对维持生理健康具有重要意义。研究发现以畜禽血等动物副产物为原料,可以获得具有功能活性的肽类物质,其活性与多肽的分子量、氨基酸组成等密切相关。鸭血浆蛋白粉中富含蛋白质和氨基酸,是制备活性肽的良好来源。为了解鸭血浆蛋白分中抗氧化肽的活性及其在细胞中的作用,本课题以鸭血浆蛋白粉为原料,通过分离纯化、RNA-Seq等手段,对鸭血浆蛋白抗氧化肽进行分离鉴定、转录组学分析及抗氧化通路研究,为揭示鸭血浆蛋白肽的抗氧化活性及其对损伤细胞的保护机制提供支撑,具体研究内容和结果如下:1.鸭血浆蛋白酶解工艺优化本章以鸭血浆蛋白粉为原料,分别采用复合蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解,筛选鸭血浆蛋白获取抗氧化肽的最适蛋白酶。为获得制备抗氧化肽的最佳工艺,通过单因素试验分析了酶解时间、温度、pH以及酶与底物比（E/S）对酶解效果的影响。然后利用响应面法对酶解条件进行优化,得到最佳酶解工艺,并进行优化验证试验,测定粗肽液的DPPH·清除率。研究结果表明鸭血浆蛋白粉的制备抗氧化肽的最适蛋白酶为碱性蛋白酶酶解,其酶解产物的DPPH·清除率为50.96%。根据单因素试验结果,以DPPH·清除能力为响应值,确定响应面的四因素三水平试验,得到最佳酶解条件为:酶解温度65.5℃、pH 10.0、时间6.0 h、E/S 0.3%,DPPH·清除率为64.84%,与模型预测值的差异不显著。因此,鸭血浆蛋白酶解产物的抗氧化活性强,具有作为功能成分用于食品或药品的前景。2.鸭血浆蛋白抗氧化肽的分离纯化及鉴定本章首先根据最佳酶解工艺,提取鸭血浆蛋白肽,然后采用超滤、G-25凝胶色谱过滤和反相高效液相色谱,对鸭血浆蛋白粗肽进行逐步纯化。并以DPPH·、O2-·和ABTS清除率为指标,对分离纯化后的多肽进行活性检测。利用nono-LC-MS/MS鉴定活性最强组分的肽序列,并人工合成后进行活性验证。结果发现超滤后分子量最小组分M1的抗氧化活性最强,M1经G25纯化后,组分B的DPPH·和O2-·和ABTS清除率均显著高于其他组分;经反相高效液相色谱分离后,组分B2的抗氧化活性显著高于其他峰;经nono-LC-MS/MS分离鉴定出7条新的抗氧化肽,人工合成后发现这7条肽都有较强的抗氧化活性。其中肽段Glu-Val-Gly-Lys表现出最强的Fe2+螯合能力;肽段Arg-Cys-Leu-Gln的还原力和ABTS、DPPH·自由基清除能力最强。3.鸭血浆蛋白肽Arg-Cys-Leu-Gln对Caco-2损伤细胞的保护作用本章首先用体外活性最强的肽Arg-Cys-Leu-Gln孵育Caco-2细胞,研究其对Caco-2的是否具有毒性和抗氧化活性。然后构建H2O2氧化损伤细胞模型,探究Arg-Cys-Leu-Gln对H2O2氧化损伤Caco-2细胞的保护作用。通过MTT试验发现,用浓度为0-1000 μg/mL的RCLQ孵育时,Caco-2细胞的存活率均在90%以上,这说明此浓度下的Arg-Cys-Leu-Gln对Caco-2细胞没有毒性。CAA试验结果表明Arg-Cys-Leu-Gln孵育可以显著提高Caco-2细胞的抗氧化活力。用MTT法测细胞存活率,发现IC50=0.992 mM,因此选用浓度为1 mM的H2O2构建氧化损伤细胞模型。然后用Arg-Cys-Leu-Gln对氧化损伤细胞进行预处理,结果发现Arg-Cys-Leu-Gln能显著提高细胞的存活率及细胞中T-SOD酶活、抑制细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的生成、减少细胞外乳酸脱氢酶（LDH）渗漏。因此表明Arg-Cys-Leu-Gln具有细胞抗氧化活性,能够有效减轻细胞氧化损伤,对氧化损伤细胞具有保护作用。4.转录组学水平分析鸭血浆蛋白肽RCLQ对Caco-2细胞的保护作用机制为了研究Arg-Cys-Leu-Gln对H2O2诱导的Caco-2损伤细胞的缓解氧化损伤作用机制,利用转录组学技术对Caco-2对照细胞、氧化损伤细胞和Arg-Cys-Leu-Gln孵育处理组的基因表达水平进行研究,筛选出差异表达基因,进行GO富集、KEGG富集和网络互作分析。结果表明,损伤组和正常组之间有113个表达显著差异基因;肽预处理组和损伤组之间有74个表达显著差异基因。通过GO和KEGG富集分析及网络互作分析发现,Arg-Cys-Leu-Gln激活了参与细胞氧化应激和细胞凋亡进程中的基因,通过调节该通路中的关键基因能显著缓解H2O2诱导的Caco-2细胞损伤。5.Arg-Cys-Leu-Gln对Caco-2细胞的保护作用机理本章从蛋白水平对转录组结果进行验证,研究鸭血浆蛋白肽Arg-Cys-Leu-Gln的细胞保护作用机理。首先检测Arg-Cys-Leu-Gln对Caco-2细胞中过氧化物酶活性及细胞凋亡的影响;然后用Western Blot进一步研究Arg-Cys-Leu-Gln对Caco-2细胞抗氧化蛋白（Nrf2 和 Keap1）以及凋亡蛋白（Bcl-2,Bax,Caspase-3 和 Caspase-9）表达的影响。结果发现Arg-Cys-Leu-Gln预处理能够有效缓解H2O2刺激对过氧化物酶的抑制作用,结合抗氧化信号通路和凋亡通路的蛋白表达可知,H2O2抑制Nrf2蛋白的表达,而Arg-Cys-Leu-Gln提前孵育可以激活Nrf2通路,提高Nrf2蛋白的表达,进而上调抗氧化物酶的活性、下调促凋亡蛋白（Bax、Caspase-3、Caspase-9）的表达、上调抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达抑制细胞凋亡,保护细胞减轻氧化损伤。以上结果说明Arg-Cys-Leu-Gln可能通过上调Nrf2基因的表达,提高Nrf2蛋白的表达水平,激活Nrf2-Keap1信号通路,发挥抗氧化作用;通过调节凋亡因子的表达,抑制细胞凋亡。两者互为响应,共同作用,进而减轻细胞氧化损伤。