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目的:探讨基于电针结合转录因子NeuroD1&DLX2基因疗法治疗大脑中动脉闭塞MCAO(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型小鼠患肢的运动功能的改善作用;分析电针对MCAO急性期小鼠的行为学及病理特征的影响;以及电针结合转录因子NeuroD1(NeuroD1,ND1)&DLX2对MCAO恢复期小鼠的行为学、病理特征的影响和将损伤脑区内的应激星形胶质细胞原位重编程为神经元的机制研究。方法:第一部分实验:1.建立MCAO急性期小鼠模型,24小时进行干预:分为MCAO+电针(Electroacupuncture,EA)组,MCAO+手针(Handacupuncture,HA)组,MCA0 组和假手术组4组;通过行为学测试,评估电针治疗在不同时间点改善MCAO小鼠急性期的运动功能;2.建立MCAO恢复期小鼠模型,30天进行干预:分为MCAO+EA组,MCAO组和假手术组3组,通过行为学测试,评估电针治疗在不同时间点对改善MCAO小鼠恢复期的运动功能;第二部分实验:将MCAO急性期小鼠干预结束进行取材切片并且免疫荧光染色NeuN评估梗死面积;染色小胶质细胞生物标志物IBA1(ionized calcium binding adapter molecule 1,IBA1)和星形胶质细胞生物标志物 GFAP(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)评估不同受损脑区的应激程度;以及对IBA1进行形态学分析评估IBA1激活后其形态学上的变化趋势;第三部分实验:1.将9只正常7-8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为3组,分别在纹状体微量注射①AAV2/5-gfaABC1D-iCre+AAV2/5-CAG-Flex-DLX2-P2A-EGFP;②AAV2/5-gfaABC1D-iCre+AAV2/5-CAG-Flex-ND1-P2A-mcherry;.③AAV2/5-gfaABC1D-iCre+AAV2/5-CAG-Flex-DLX2-P2A-EGFP+AAV2/5-CAG-Flex-ND1-P2A-mCherry病毒,于病毒注射后第7 d、14 d和28 d进行灌流切片和荧光染色共标NeuN,观察在不同时间点转录因子NeuroD1&DLX2与NeuN的重合率;2.将MCAO恢复期模型的50只雄性小鼠采用随机数字表法随机分为5组,分别为假手术组,MCAO+ND1+DLX2 组,MCAO+ND1+DLX2+EA 组,MCAO+EA 组,MCAO+GFP(Green fluorescent protein,GFP)组,通过行为学测试评估不同时间点改善MCAO小鼠恢复期的运动功能;将干预结束的小鼠免疫荧光染色NeuN与转录因子NeuroD1&DLX2的重合率、评估梗死面积,以及染色GFAP评估病灶侧GFAP的应激程度。结果:1.第一部分实验:1.1行为学观察MCAO急性期小鼠在去除黏纸测试中,在电针7 d、14 d和30 d,与MCAO模型组相比,MCAO+EA组和MCAO+HA组有差异,并差异均有统计学意义(P<0.05);走格子测试中,电针30 d与MCAO模型组相比,MCAO+EA组和MCAO+HA组有差异,并差异均有统计学意义(P<0.05),表明随着电针治疗时间的增加,MCAO急性期小鼠患肢的高级运动功能逐步改善。1.2行为学观察MCAO恢复期小鼠在走格子测试和爬杯测试,与MCAO模型组相比,MCAO+EA组在不同时间点并无改善趋势,表明电针疗法没有缓解MCAO恢复期小鼠患肢的运动功能。2.第二部分实验:2.1梗死面积:电针30天与MCAO模型组对比,MCAO+EA组、MCAO+MA组梗死面积差异具有统计学意义(P<0.05);说明电针和手针可以有效减少梗死面积,保护脑区的受损组织。2.2不同受损脑区IBA1平均荧光强度:电针30天MCAO+EA组和MCAO+MA组都有不同程度的改善受损脑区IBA1的应激程度和表达水平。与MCAO组相较,在核心梗死区,MCAO+EA组和MCAO+MA组有效降低IBA1的表达水平且差异均有统计学意义(P<0.05);在缺血半暗带区,MCAO+EA组和MCAO+MA组均有降低IBA1的表达水平的趋势;在病灶侧皮层区,MCAO+EA组有效降低IBA1的表达水平且差异均有统计学意义(P<0.05),MCAO+MA组有降低的趋势。2.3不同受损脑区GFAP平均荧光强度:电针30天MCAO+EA组和MCAO+MA组都有不同程度的改善受损脑区GFAP的应激程度和表达水平。与MCAO组相较,在核心梗死区和缺血半暗带区,MCAO+EA组和MCAO+MA组有效降低GFAP的表达水平且差异均有统计学意义(P<0.05);在病灶侧皮层区,MCAO+EA组和MCAO+MA组均有降低GFAP的表达水平的趋势。2.4核心梗死区IBA1形态学分析:电针30天MCAO+EA组和MCAO+MA组都显著的缓解IBA1形态上的应激变化;与MCAO组相较,MCAO+EA组和MCAO+MA组有效显著降低IBA1聚集细胞数、显著增加突起分支数和分支长度且差异均有统计学意义(P<0.05)。2.5缺血半暗带区IBA1形态学分析:电针30天MCAO+EA组和MCAO+MA组都不同程度缓解IBA1形态上的应激变化;与MCAO组相较,MCAO+EA组和MCAO+MA组有效显著降低IBA1聚集细胞数、显著增加突起分支数且差异均有统计学意义(P<0.05);MCAO+EA组显著增加分支长度且差异有统计学意义(P<0.05),MCAO+MA组有增加的趋势。2.6病灶侧皮层区IBA1形态学分析:电针30天MCAO+EA组和MCAO+MA组都不同程度的缓解IBA1形态上的应激变化;与MCAO组相较,MCAO+MA组有效显著降低IBA1聚集细胞数且差异有统计学意义(P<0.05),MCAO+EA组有降低的趋势;MCAO+EA组和MCAO+MA组有效显著增加突起分支数和分支长度且差异有统计学意义(P<0.05)。3.第三部分实验:3.1在正常小鼠脑区微量注射转录因子ND1+DLX2后观察应激性胶质细胞转化为功能性神经元,侵染脑区应激性星形胶质细胞7天后转化率为8%左右,14天的转化率 46%,30 天的 65%;3.2行为学观察结果:走格子测试中干预14天,与MCAO+GFP组相较,MCAO+ND1+DLX2组与其差异有统计学意义(P<0.05);干预30天,与MCAO+GFP组相较,MCAO+ND1+DLX2组和MCAO+ND1+DLX2+EA组与其差异有统计学意义(P<0.05);爬杯测试示干预30天时与MCAO+GFP组相较,MCAO+ND1+DLX2组、MCAO+ND1+DLX2+EA组和MCAO+EA组与其差异有统计学意义(P<0.05);干预60天时与MCAO+GFP组相较,MCAO+ND1+DLX2 组、MCAO+ND1+DLX2+EA 组差异有统计学意义(P<0.05),ND1+DLX2 和结合电针均能够一定程度降低MCAO恢复期小鼠走格子踩空率和爬杯的拖拽率。3.3 MCAO恢复期小鼠梗死面积:干预60天与MCAO+GFP组对比,MCAO+ND1+DLX2梗死面积差异具有统计学意义(P<0.05);说明ND1+DLX2较空载组可以有效减少梗死面积,保护脑区受损组织。3.4 MCAO恢复期小鼠病灶侧GFAP表达水平统计结果:与MCAO+GFP组相较,MCAO+ND1+DLX2组差异均有统计学意义(P<0.05),ND1+DLX2干预方式比空载组对MCAO小鼠病灶侧星形胶质细胞平均荧光强度有显著的降低的作用。3.5 MCAO恢复期小鼠纹状体ND1+DLX2将应激性星形胶质细胞转化为功能性神经元的转化率结果:当注射14天后,转化率达到39%左右;在注射后30天达到转化率53%,当注射60天后,转化率仍在53%左右。结论:1.针刺可以有效改善MCAO急性期小鼠运动功能,减少脑梗死损伤面积,保护脑组织;减轻不同受损脑区胶质细胞的应激炎症反应;同时改善受损脑区小胶质细胞的形态异常;针刺MCAO恢复期小鼠效果较急性期差,故针刺要早期介入缺血性中风的治疗,利于后期恢复和治疗。2.神经转录因子ND1+DLX2有效将正常小鼠纹状体的应激性星形胶质细胞转化为神经元,脑内原位转化技术为治疗疾病提供了多一种选择和可能,为今后应用于临床累积厚实的理论技术基础。3.神经转录因子ND1+DLX2可以有效改善MCAO小鼠恢复期患肢的运动功能,明显减少脑梗死损伤面积;有效减轻梗死灶侧的星形胶质的应激炎症反应;同时将应激性星形胶质细胞转化为神经元。