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第一章结核抗原持续刺激致T细胞耗竭实验研究结核病是一种慢性感染性疾病,由结核分枝杆菌感染引起,是全球危害最为严重的传染病之一。有研究报道严重的结核病患者CD4+T细胞,尤其是Th1细胞数目下降。我们也发现痰菌阳性的纤维空洞型结核病患者对结核分枝杆菌抗原的T细胞免疫应答能力低于密切接触者和结核病新发病人。以上现象都提示严重的结核分枝杆菌感染可能造成机体免疫功能低下,其发生机制值得深入研究。目的:通过结核抗原持续刺激建立T细胞耗竭小鼠模型,分析抗原持续刺激在结核病T细胞耗竭中的作用及可能的机制和治疗措施。方法:1,本研究采用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)免疫C57BL/6小鼠,用结核亚单位蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(简称LT70)联合Mtb10.4-Hsp X(简称MH)反复免疫10次,模拟结核分枝杆菌抗原持续刺激的状态,建立T细胞耗竭模型。2,通过酶联免疫斑点试验和酶联免疫吸附试验分析脾脏T细胞IFN-γ和IL-2的分泌水平;通过流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞数目;通过TB10.44-12五聚体标记检测TB10.4特异性的记忆性CD8+T细胞数目;通过流式细胞术检测CD4+/CD8+T细胞表面程序性死亡受体1(Programmed Death 1,PD-1)的表达;通过BCG和铜绿假单胞菌攻击,检测不同模型组保护效果差异;进一步检测CD34-LinSca-1+c-Kit+造血干细胞的数量和增殖能力。3,在T细胞耗竭模型基础上,应用造血干细胞、间充质干细胞、IL-2和雷帕霉素进行干预治疗,检测以下指标:抗原特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平;TB10.4特异性的记忆性CD8+T细胞的数量;CD4+T细胞表面抑制性受体PD-1的表达;BCG攻击后的保护效果;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干细胞的数量和增殖能力。通过上述指标检测评价不同治疗方案的治疗效果。4,在IL-2具有逆转T细胞耗竭作用的基础上,进一步探索IL-2与造血干细胞增殖分化相关信号通路JAK-STAT和PI3K之间的关系,揭示IL-2逆转T细胞耗竭的分子机制。结果:1,通过BCG免疫一次,结核亚单位疫苗LT70和MH加强免疫10次,成功建立T细胞耗竭模型。2,相比于结核抗原短暂刺激(加强免疫2次)组,T细胞耗竭组:细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平显著性降低(p<0.01);CD4+、CD8+T细胞数目显著性减少(p<0.05);TB10.44-12特异性的记忆性CD8+T细胞数量显著减少(p<0.05);CD4+T细胞表面抑制性受体PD-1表达水平升高(p<0.05);BCG和铜绿假单胞菌攻击后清除率下降(p<0.05),机体抗感染保护能力明显下降;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干细胞的数量降低,其增殖能力被抑制(p<0.05)。3,应用造血干细胞、间充质干细胞、IL-2和雷帕霉素进行干预治疗后,相比于T细胞耗竭组,造血干细胞治疗组和IL-2治疗组具有逆转T细胞耗竭的作用:细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平显著升高(p<0.05);TB10.4特异性的记忆性CD8+T细胞的数量增加(p<0.05);CD4+T细胞表面抑制性受体PD-1表达水平下降(p<0.01);BCG攻击后,造血干细胞治疗组和IL-2治疗组的细菌载量显著低于T细胞耗竭未治疗组;CD34-Lin-Sca-1+CD117+造血干细胞的增殖能力恢复(p<0.05)。4,通过造血干细胞增殖分化相关通路JAK-STAT和PI3K研究发现,激酶3(Janus Kinase 3,JAK3)蛋白主要在造血细胞中表达,T细胞耗竭组中骨髓造血干细胞内转录因子STAT-5磷酸化水平被抑制,IL-2治疗后可以恢复STAT-5的磷酸化。结论:应用结核抗原持续刺激建立T细胞耗竭动物实验模型,该模型从一个侧面说明大量细菌(抗原)刺激是结核分枝杆菌引起机体免疫功能低下的机制之一;T细胞耗竭后小鼠受特异性抗原刺激时IFN-γ等细胞因子分泌水平下降,CD4+和CD8+T细胞数目和增殖能力下降,CD4+T细胞表面抑制性受体PD-1表达上调,造血干细胞分化为T细胞的能力降低;应用造血干细胞、IL-2治疗后T细胞耗竭得以逆转;进一步的研究发现IL-2主要通过激活JAK-STAT信号通路,使得转录因子STAT-5磷酸化,调控造血干细胞的增殖分化,从而恢复骨髓造血干细胞向T细胞分化的能力。第二章结核分枝杆菌融合蛋白LT70的构建及其保护效果研究结核病由结核分枝杆菌感染引起,是全球传播范围最广、持续时间最久、危害最为严重的传染病之一。二十世纪八十年代以来,随着耐药菌株尤其是耐多药结核菌及人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的传播与流行,结核病在世界各地的发病率呈现回升趋势,发病率和死亡率高居不下。现阶段结核病防治所使用的疫苗BCG是减毒牛分枝杆菌活疫苗。自1921年用于人类接种,能够有效预防新生儿和儿童患严重的脑膜结核及全身粟粒性结核病,但是不能有效预防成人肺结核的发生。因此,新型结核疫苗的研究开发迫在眉睫。目的:通过建立针对休眠菌在内的不同生长状态的结核分枝杆菌有效的免疫应答,提高亚单位疫苗的免疫保护效力。方法:1,本研究选用结核分枝杆菌生长期抗原ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64的190-198位的氨基酸多肽和潜伏期保护性抗原Hrp1(Rv2626c),构建无标签融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)。2,该融合蛋白在大肠埃希菌E.coli BL21菌株中进行表达;通过条件优化,使该蛋白可溶性表达;进而利用疏水柱层析和分子筛层析方法对其进行纯化。3,将纯化产物与佐剂二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)混合制备结核亚单位疫苗LT70,分别在小鼠模型和家兔模型评价亚单位疫苗LT70免疫学效应及保护效率,并进行BCG初免后亚单位疫苗的强化免疫策略研究。结果:1,LT70融合蛋白在大肠埃希菌E.coli BL21中可溶性表达,应用疏水柱Butyl-FF层析和分子筛G-75的纯化方法成功将其分离纯化。2,在小鼠模型免疫学评价中,亚单位疫苗LT70诱导产生的抗原特异性IFN-γ水平和抗体Ig G1、Ig G2c水平显著高于BCG组和PBS组,具有较强的免疫原性。3,疫苗免疫30周后进行结核分枝杆菌H37Rv毒株气雾攻击,LT70疫苗显示出较强的免疫保护力(5.4±0.38 Log10 CFU),其保护效果强于BCG(6.01±0.33 Log10CFU)和PBS组(6.53±0.26 Log10 CFU);BCG初免后亚单位疫苗LT70具有加强BCG的免疫效果(5.62±0.64 Log10 CFU)(p=0.26)。结论:结核亚单位LT70疫苗可诱导较强的抗原特异性细胞和体液免疫应答;在小鼠模型中具有较好的清除和抑制结核分枝杆菌的作用,其保护效果强于BCG,有望成为结核病防治的有效候选疫苗。第三章结核亚单位疫苗DPC佐剂的研究及其应用新型结核亚单位疫苗需要佐剂辅助以诱导较强的免疫应答。选择适当的佐剂不仅提高免疫应答的水平,也可以改变免疫应答的类型。疫苗靶向细胞内病原体如结核分枝杆菌,需要诱导细胞免疫应答,包括活化CD4 Th1型辅助T细胞和CD8细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)。然而,当前在临床上使用的佐剂只有铝佐剂,该佐剂可促进Th2型体液免疫应答,无法引起Th1型细胞免疫应答。因此,研发新的可诱导Th1型细胞免疫应答的佐剂对结核疫苗的发展至关重要。我们在前期研究中,以阳离子脂质体DDA为基础,联合Toll样受体3激动剂Poly I:C能诱导较强的Th1型细胞免疫应答和较强的免疫保护效果。但是佐剂DDA-Poly I:C(简称DP)的稳定性较差,易发生絮凝现象,无法满足临床疫苗的需要。目的:我们在佐剂DP的基础上,研究增强佐剂稳定性的方法,以构建更加稳定和有效的新型免疫佐剂,利于后期的研发和生产。方法:1,以佐剂DP为基础,联合不同辅料,通过粒径和zeta电位等指标评价佐剂的理化性状和稳定性,从而筛选可增强佐剂DP稳定性的辅料。2,利用乳化-溶剂挥发法,将DDA和Poly I:C联合胆固醇制成阳离子脂质体佐剂DDA-Poly I:C-胆固醇(简称DPC),并与融合蛋白LT70联合构建结核亚单位疫苗LT70-DPC。3,在C57BL/6小鼠模型上进行LT70-DPC疫苗的免疫学评价和保护效率评价:0,2,4周进行LT70-DPC疫苗的免疫,末次免疫后6周进行免疫指标的检测,30周后结核分枝杆菌H37Rv菌株攻击,攻击10周后检测保护效率。结果:1,使用胆固醇联合DDA和Poly I:C构建新型疫苗佐剂DPC。2,通过佐剂的理化性状分析结果显示新型佐剂DPC较佐剂DP粒径由约500nm降至约400nm,大小均一;同时,随着胆固醇的加入,佐剂DP的Zeta电位由23.48(±2.93)升高至41.22(±4.04),佐剂DP的稳定性得以明显提升。3,将佐剂DPC与融合蛋白LT70联合,构建结核亚单位疫苗LT70-DPC。通过C57BL/6小鼠模型进行免疫学评价,结果显示LT70-DPC疫苗和LT70-DP疫苗均可诱导产生较高的抗原特异性IFN-γ水平和抗体Ig G1、Ig G2c水平,其水平显著高于BCG组和PBS组(p<0.05)。4,在小鼠保护效率实验中,结核亚单位疫苗LT70-DPC具有较强的免疫保护力,LT70-DPC组肺部细菌载量(5.43±0.37Log10 CFU)与疫苗LT70-DP组细菌载量(5.4±0.38 Log10 CFU)相当,均低于BCG组(6.01±0.33 Log10 CFU);同时,结核分枝杆菌H37Rv毒株攻击后,疫苗LT70-DPC组的病理损伤面积(7.4±0.04%)显著低于疫苗LT70-DP组(12.2±0.01%)(p<0.05)。结论:新型佐剂DPC增加了佐剂DP的稳定性,利于后期的研发和生产;结核亚单位疫苗LT70-DPC可以诱导小鼠产生较强的特异性细胞和体液免疫应答;在小鼠保护效率实验中,疫苗LT70-DPC的保护效果强于BCG,且明显降低了小鼠肺组织病理损伤,有望成为具有临床应用价值的有效的结核亚单位疫苗佐剂。