研究背景:我国拥有着广阔的农业种植地,农药的使用不可避免。使用农药大大增加了农产品产量,带来经济效益,但长期或大量使用农药会使其残留在食物和环境中,通过饮食、皮肤接触等途径进入人体,造成多种器官组织损伤,农药使用带来的危害日益成为社会关注焦点。同时农药使用种类多样,常常混配、交替施用。不同有毒物质在生物体内相互作用方式不同,其复合污染与单一污染对有机体的毒性效应会有所不同,联合暴露能够更加准确、真实反映污染物的毒性效应,为环境毒理学和复合污染物风险评估提供数据支持。毒死蜱和苯醚甲环唑是两种使用广泛、广谱性强的农药,均表现出明显的肝毒性,但其联合毒性作用机制尚不明确,值得我们探索。研究目的:本课题通过体外细胞实验,研究农业生产中使用广泛的毒死蜱和苯醚甲环唑单一及联合暴露对人正常肝细胞L-02损伤影响,探究毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露对L-02细胞可能引起的基因表达差异变化,进一步研究其相关的信号通路变化,明确靶点分子,评价毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露的毒性效应,为评估农药联合毒性机制提供科学依据。研究方法与结果:1、Cell titer检测法测定不同浓度下毒死蜱和苯醚甲环唑单剂及联合暴露24 h后对L-02细胞存活率、形态、凋亡率的影响,并验证其时间-剂量反应关系,结果显示毒死蜱、苯醚甲环唑单独及联合暴露于L-02细胞24h后细胞形态发生明显改变,细胞活力显著降低,联合暴露诱导细胞凋亡率显著提高,通过计算得出毒死蜱、苯醚甲环唑对L-02细胞IC50分别为73.75μmol/L和108.8μmol/L。2、ELISA等测定细胞内ROS水平、SOD活力、GSH活力、MDA含量表达水平变化,研究毒死蜱和苯醚甲环唑单独及联合暴露24 h诱导细胞氧化应激效应,实验结果显示毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露可明显增加L-02细胞ROS的生成,降低细胞内SOD和GSH活性,降低抗氧化能力,进而加重氧化损伤程度,诱导细胞MDA含量升高,最终导致L-02细胞产生氧化应激效应。3、转录组学测序方法检测毒死蜱和苯醚甲环唑单独及联合暴露后L-02细胞内差异基因的表达水平变化,通过GO功能富集分析,KEGG通路富集分析等方法探讨毒死蜱、苯醚甲环唑单独和联合暴露L-02细胞诱导其凋亡的可能调控机制,并通过RT-q PCR技术验证转录组测序结果的可靠性,为评估农药联合暴露毒性机制提供科学依据。结果显示,毒死蜱和苯醚甲环唑单独及联合暴露后诱导L-02细胞内基因差异表达变化,说明毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露L-02细胞激活内质网应激信号通路。4、通过RT-qPCR和Western blot技术对显著激活的内质网应激信号通路的相关因子PERK、ERO1-Lα、IRE1α、CHOP、BIP在基因转录水平及蛋白水平的表达进行分析,探讨内质网应激信号通路在人正常肝细胞L-02损伤中的作用机制。结果显示内质网应激相关因子PERK、ERO1-Lα、IRE1α、CHOP、BIP的m RNA和蛋白表达水平呈现显著上调。5、通过添加IRE1α激酶抑制剂Kira6检测相应的细胞活力,细胞内ROS含量、SOD活力、GSH活力和细胞内MDA含量等氧化应激指标及内质网应激相应基因m RNA和蛋白表达水平等,进一步验证毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露诱导L-02细胞内质网应激的作用机制。结果表明,Kira6明显降低毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露诱导的L-02细胞凋亡率,缓解细胞氧化应激效应,并显著降低联合暴露组内质网应激相关因子IRE1α、CHOP、BIP的m RNA和蛋白表达水平。研究结论:针对以上实验结果,我们得出以下结论:1、毒死蜱、苯醚甲环唑单独和联合暴露均具有明显的L-02细胞毒性,诱导细胞凋亡,联合暴露组毒性作用更明显。2、毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露可明显提高细胞内ROS水平,降低细胞内SOD和GSH活性,降低抗氧化能力,加重氧化损伤程度,诱导细胞MDA含量升高,产生氧化应激效应。3、毒死蜱和苯醚甲环唑联合暴露诱导IRE1α主导的信号通路关键蛋白表达,激活内质网应激通路,提高氧化应激效应,造成细胞损伤。本论文的实验结果可为有机磷农药毒死蜱和三唑类农药苯醚甲环唑的毒理学研究提供一定的数据支持,同时也为有机磷和三唑类农药残留混合污染风险评估提供了一定的参考。