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背景:相分离（相变）在自然界中普遍存在,原本是个物理学概念。近年来,随着生命科学领域的研究推进,相分离现象被越来越多地在许多生命过程中观察到。在传统生物学概念中,细胞内包含大量的有膜细胞器,如线粒体、细胞核等。这些细胞器具有单层或多层膜结构,将其自身与外界环境隔离开来,为细胞内各类生化反应的高效进行提供了保障。近年来,越来越多的研究发现,细胞内存在一类无膜功能单元,如核仁、应激颗粒、自噬小体、P颗粒等,同样可以与外界环境发生频繁的物质交换,然而其形成机制,一直未有定论。相分离理论认为,细胞内某些蛋白质和核酸分子可以通过较弱的多价相互作用,在原本的相中逐渐形成物理性质不同的另一相,即无膜细胞器。这为解释无膜功能单元的形成提供了重要突破口。细胞内特定分子相分离过程的正常进行有助于实现细胞内功能区域的合理划分,协助细胞正常生理活动的开展。另一方面,细胞内相分离异常也往往与多种疾病密切相关,包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）、额颞叶痴呆（Frontotemporal Dementia,FTD）以及阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）等神经退行性疾病。值得一提的是,相分离过程与机体免疫系统密切相关,不仅参与适应性免疫中T cell receptor（TCR）信号分子转导,还参与天然免疫DNA识别信号通路中cGAS的激活。2013年,西南医学中心陈志坚教授首次发现了胞质内DNA感受器cGAS的存在。cGAS即环磷酸鸟苷-腺苷合成酶,可识别胞质内DNA后通过自身构象改变而活化,并进而以ATP和GTP为原料合成第二信使2’,3’-c GAMP,最终激活下游干扰素信号通路。2018年,陈志坚教授发现DNA能诱发cGAS发生相分离,导致其由弥散状态向液滴样状态转变,这一过程使得cGAS-DNA复合物成为一个高度凝集的“微型反应器”——cGAS蛋白质、DNA、ATP、GTP在其中被高度浓缩从而大大增强了效应分子c GAMP的产生。此外,该工作还发现游离的锌离子能够通过促进cGAS-DNA的相分离从而增强cGAS的酶活性。另一类核酸相关的无膜细胞器叫作应激颗粒,它是由RNA和蛋白质组成的动态无膜细胞器,主要由冷热刺激、氧化应激、营养缺乏或病毒感染等外界环境压力诱发。G3BP1（G3BP stress granule assembly factor 1）是应激颗粒调控的核心蛋白质,包含了一类特殊的结构域即内在无序区（Intrinsically disordered regions,IDRS）,该区域参与介导蛋白质与蛋白质以及蛋白质与核酸之间弱相互作用,并且对诱导相分离的发生具有关键作用。课题组前期发现G3BP1能促进cGAS的激活,为了进一步揭示G3BP1调控cGAS激活的分子机制,我们对其在cGAS相分离中的作用进行了研究。目的:揭示G3BP1在cGAS相分离过程中发挥的作用,为cGAS蛋白质的调控以及相关疾病的治疗提供新思路。方法:我们首先利用大肠杆菌原核表达系统对cGAS蛋白质、G3BP1蛋白质的不同截短体进行了表达纯化,进一步通过体外浊度检测、Time-lapse、荧光漂白恢复（Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP）等实验对G3BP1在DNA诱导的cGAS相分离中的作用进行了探索。细胞水平,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了敲除G3BP1基因的U937细胞系,并基于免疫荧光成像、实时荧光定量PCR、pull-down等技术评价了G3BP1对DNA刺激下cGAS相分离的形成及其介导干扰素表达的影响。结果:G3BP1促进cGAS蛋白质预凝集液滴的形成,增加了反应体系的浑浊度,上述现象与G3BP1的浓度成正相关。Time-lapse结果显示:双链DNA（Double-stranded DNA,ds DNA）诱发的cGAS蛋白质相分离与ds DNA的浓度成正相关,随着ds DNA浓度的增加,cGAS蛋白质相分离形成的液滴大小和数量明显增多。重要的是,G3BP1则进一步增强了该过程。荧光漂白恢复结果显示:G3BP1与cGAS共孵育形成的液滴经历荧光漂白后在较长的观察时间无明显荧光强度的恢复,说明G3BP1与cGAS共孵育形成的液滴内部流动性较差。进一步,我们利用G3BP1的多种截短体与cGAS以及ds DNA共孵育并观察了液滴的形成过程,结果显示仅有全长的G3BP1能够增强DNA诱发的cGAS的相分离。不仅如此,通过检测cGAS下游c GAMP的合成情况,结果同样表明仅有全长的G3BP1能明显增加cGAS的激活。上述发现在细胞水平也得到了验证。相比于WT细胞,G3BP1基因敲除的细胞在DNA刺激下cGAS凝集物的形成数量明显减少,表明G3BP1同样能够促进细胞内DNA诱导的cGAS相分离。此外,通过检测下游干扰素的表达水平,我们发现G3BP1的敲除能够抑制不同剂量ds DNA诱导的cGAS下游干扰素的表达,表明G3BP1在cGAS介导的干扰素信号通路中发挥了重要作用。结论:全长的G3BP1能够促进cGAS预凝集状态的形成,进一步增强DNA诱发的cGAS相分离及其激活。