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目的:探讨PTX3和miR-25-3p对间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)生物学特性的影响。内容:1.培养鉴定人脐带来源MSC(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUC-MSC)和小鼠骨实质来源的MSC;炎症因子刺激hUC-MSC,发现PTX3表达水平升高,生物信息学分析PTX3的功能。2.构建过表达PTX3的慢病毒载体,转染并筛选稳定过表达PTX3的hUC-MSC3.体外实验探讨PTX3对hUC-MSC一般生物学特性的影响4.建立小鼠aGvHD模型,通过体内实验探究PTX3调控hUC-MSC治疗aGvHD的疗效5.体外实验探讨小鼠骨实质来源miR-25-3p对其成脂分化功能的影响方法:1.对体外分离培养的hUC-MSC和小鼠骨实质来源MSC,通过倒置显微镜、流式细胞术鉴定其细胞形态和细胞表型,油红O染色、碱性磷酸酶染色法和q-PCR检测MSC的诱导分化能力,q-PCR检测经炎症因子刺激后hUC-MSC中PTX3表达量,生物信息学分析PTX3发挥相关功能的可能途径。2.构建过表达PTX3的慢病毒载体并将其转染hUC-MSC,通过流式细胞术检测慢病毒载体的转染效率,q PCR和Western blot检测PTX3在m RNA和蛋白水平的表达情况,获得稳定过表达PTX3的hUC-MSC(hUC-MSC-PTX3)和对照载体的hUC-MSC(hUC-MSC-NC)。3.倒置显微镜观察hUC-MSC-PTX3和hUC-MSC-NC的细胞形态,流式细胞术检测细胞表型,油红O染色、碱性磷酸酶染色法和q PCR检测两组细胞的诱导分化能力;流式细胞术和CCK-8检测两组细胞的细胞周期和细胞的增殖能力。4.将hUC-MSC、hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC与小鼠脾脏来源的CD3+T细胞共培养,流式细胞术检测各组MSC细胞对T细胞增殖的影响,q PCR检测共培养各组T细胞炎症因子的表达;进一步分离小鼠骨髓单核细胞,加入hUC-MSC、hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC浓缩的培养上清,诱导M1型巨噬细胞,流式细胞术检测各组巨噬细胞比例,q PCR检测各组M1型巨噬细胞分化标志物的表达。5.建立小鼠aGvHD模型,尾静脉注射hUC-MSC、hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC并观察其疗效,通过记录小鼠的体重、生存率和临床表现的Cook评分评估各组小鼠一般生存状态;HE染色评价各组小鼠的肝、肺、小肠及肛周皮肤的病理学改变;免疫组化染色检测各组小鼠肝脏巨噬细胞和小肠中IL-17A和Foxp3的表达;流式细胞术检测各组小鼠腹腔巨噬细胞比例。结果:1.体外分离培养的MSC呈成纤维状贴壁生长,细胞高表达CD73、CD90、CD105,低表达或不表达CD14、CD34、CD45,具有成脂成骨的分化能力,符合MSC的判定标准,炎症因子刺激hUC-MSC后高表达PTX3,生物信息学分析发现PTX3可能影响hUC-MSC的免疫调节功能。2.成功构建过表达PTX3的慢病毒载体,流式细胞术检测结果显示,PTX3转染hUC-MSC的效率达95%以上,q PCR和Western blot结果证实,转染PTX3慢病毒载体的hUC-MSC在m RNA和蛋白水平高表达PTX3,获得稳定过表达PTX3的hUC-MSC(hUC-MSC-PTX3)和对照载体转染的hUC-MSC(hUC-MSC-NC)。3.hUC-MSC-PTX3和hUC-MSC-NC进行MSC生物学特性鉴定,结果表明,PTX3并未改变hUC-MSC的细胞形态和表型特征;诱导分化实验表明PTX3具有促进hUC-MSC成脂分化,抑制hUC-MSC成骨分化的作用;细胞周期和CCK-8检测结果显示,PTX3并不影响hUC-MSC的细胞周期和细胞的增殖能力。4.体外T细胞增殖实验结果表明,hUC-MSC-PTX3抑制T淋巴细胞增殖能力显著降低;体外M1型巨噬细胞分化的实验结果表明,hUC-MSC-PTX3可有效促进M1型巨噬细胞的分化。5.hUC-MSC-PTX3、hUC-MSC-NC和hUC-MSC治疗aGvHD小鼠的疗效观察,结果表明,hUC-MSC-PTX3组小鼠较hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组的存活率显著降低;临床Cook评分结果显示,hUC-MSC-PTX3组较hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组临床症状显著升高;H&E染色结果表明,与hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组相比,hUC-MSC-PTX3组小鼠的肝、肺、小肠和皮肤组织病理损伤严重,炎性细胞浸润多;免疫组化结果显示,hUC-MSC-PTX3组M1型巨噬细胞比例显著增多,且高于hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组,低于aGvHD组;小肠组织IL-17A和Foxp3免疫组化结果表明,hUC-MSC-PTX3组IL-17A和Foxp3在小肠组织中的表达较hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组显著升高;流式细胞术检测各组小鼠腹腔巨噬细胞比例,结果表明,hUC-MSC-PTX3组M1型和M2型巨噬细胞的比例均较hUC-MSC组与hUC-MSC-NC组显著升高。提示过表达PTX3导致hUC-MSC治疗aGvHD的疗效减弱。6.miR-25-3p mimic转染小鼠MSC,荧光显微镜下观察细胞,可见大量红色荧光,q-PCR检测转染细胞miR-25-3p表达显著升高(P<0.001)。转染细胞成脂诱导分化结果表明,与NC组相比,miR-25-3p mimic诱导组油红O染色的红色脂滴数显著减少;q PCR和Western blot检测结果显示,miR-25-3p mimic可显著抑制成脂关键转录因子CEBPα和PPARγ的表达。结论:PTX3可有效促进hUC-MSC的成脂分化,抑制其成骨分化,且具有促进T细胞增殖和M1型巨噬细胞分化的作用。miR-25-3p参与调控MSC的成脂分化。