【摘 要】
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桑树是多年生、多用途的经济木本植物。桑树病害影响桑叶的叶质和产量,重要病害之一桑花叶型萎缩病危害日趋严重,但对其病原的有效检测和防治研究基本欠缺。为探究桑花叶型萎缩病病原及其发生规律,本论文对2017年至2019年期间由中国11个省份采集的各季节的590份桑花叶型萎缩病症状的桑叶病样,分别就MMDaV、MVBaV和桑植原体Candidatus Phytoplasma asteris MD三种病原进
【基金项目】
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国家现代农业产业技术体系建设专项资金（cars-18-zj0304）； 广东省农业发展和农村工作专项资金（2017LM4168）； 广东省科技计划项目（2018A050507001）； 广东省省级乡村振兴战略专项资金（粤财农[2018]143号）； 广东省公益研究
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桑树是多年生、多用途的经济木本植物。桑树病害影响桑叶的叶质和产量,重要病害之一桑花叶型萎缩病危害日趋严重,但对其病原的有效检测和防治研究基本欠缺。为探究桑花叶型萎缩病病原及其发生规律,本论文对2017年至2019年期间由中国11个省份采集的各季节的590份桑花叶型萎缩病症状的桑叶病样,分别就MMDaV、MVBaV和桑植原体Candidatus Phytoplasma asteris MD三种病原进行了分子检测,并对Ca.P.asteris MD进行了基因组测序和分析;分别筛选了适用于三种病原特异检测的靶基因,建立了检测技术体系;结合转录组学和电镜技术,分别从分子和细胞水平对桑树响应桑花叶型萎缩病潜在病原MMDaV和桑植原体侵染的机制进行初步研究。主要结果如下:（1）对表现为桑花叶型萎缩病症状的桑树病叶进行分子检测的结果显示,MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD三种病原存在一种或多种混合感染桑树的现象。其中,MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD单一检出率分别是53.72%、23.90%、48.14%;MMDaV+Ca.P.asteris MD的检出率为28.98%,MVBaV+Ca.P.asteris MD检出率为6.27%,MMDaV+MVBaV检出率为11.02%,三者同时检出率为1.02%;在夏季样本中,MMDaV和Ca.P.asteris MD的检出率最高,MVBaV的检出率为0,表现出隐症现象。（2）通过高通量测序获得桑植原体Ca.P.asteris MD-GZ-1的全基因组序列,其大小为620028 bp,内有1个4502 bp的p MDGz-1质粒。（3）三种相关病原的系统发育分析结果表明:桑树MMDaV类群与柑橘褪绿矮缩病毒CCDaV（JQ920490）的关系最近（相似性75.65%-78.26%）;MVBaV类群与辣椒褪绿病毒Ca CV（DQ256124/DQ256125/DQ256123）的关系最近（相似性75.13%-76.54%）;桑植原体Ca.P.asteris MD-GZ-1与洋葱黄花病的Ca.P.asteris OY-M（AP006628）的关系最近（全基因组相似性99%,覆盖度90%）。（4）成功筛选到MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD的检测靶基因,分别为Rep A、N和ltr A,并建立了相应的分子检测技术体系,即MMDaV-LAMP检测试剂盒（CN201810599352.9）、MVBaV-RT-LAMP检测试剂盒（CN201810998181.X）和桑植原体PCR检测试剂盒（CN201910927209.5）。（5）差异表达基因分析显示桑树响应MMDaV和桑植原体侵染的DEGs分别为835个和3664个;两种情况下桑树转录组的GO分析主要在细胞的催化活性、膜功能上显示为极显著,而KEGG则主要表现在淀粉和糖代谢、植物激素信号转导、植物病原互作等代谢通路。对其中DEGs分析为显著差异表达的桑树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因1（Mn KPI-1）进行的q PCR验证,结果表明Mn KPI-1在两种病原侵染后表达上调,可能参与桑树对相关病原的免疫。（6）电镜结果显示,患病桑叶组织细胞中可清晰观察到MMDaV病毒粒子和Ca.P.asteris MD菌体,且患病桑叶的细胞器和内膜系统均发生较明显的变化:患病桑叶细胞明显萎缩,畸形,质壁分离,细胞壁变厚,淀粉粒变大,叶绿体膨大裂解,油脂滴数量增多且体积变大,多囊泡体（MVB）变多,外泌体增多,并发生木质部自溶等现象。（7）成功分离了桑叶外泌体,其直径约100 nm,内含规则形状的结晶状颗粒。综上,本研究首次报道了桑植原体基因组,创新研制了MMDaV、MVBaV和Ca.P.asteris MD三种病原分子检测技术和产品;研究发现桑树在响应病原侵染时,桑树Mn KPI-1基因表达上调,组织细胞中出现了较多的多囊泡体和外泌体。本研究结果将为桑病毒病及植原体病绿色防控提供理论参考。
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