【摘 要】
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近年来,基因编辑技术快速发展,ZFN、TALENs以及CRISPR/Cas9等众多基因编辑技术广泛用于生物技术各个领域,尤其以CRISPR/Cas9设计方便,突变高效快捷倍受关注应用,该技术已成功构建了多种具有抗性的作物。CRISPR/Cas9系统是利用单链导向RNA（single-guide RNA,sgRNA）识别与之配对的外源靶向基因,并对其进行编辑,从而达到对靶向基因进行突变的目的。但由于
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近年来,基因编辑技术快速发展,ZFN、TALENs以及CRISPR/Cas9等众多基因编辑技术广泛用于生物技术各个领域,尤其以CRISPR/Cas9设计方便,突变高效快捷倍受关注应用,该技术已成功构建了多种具有抗性的作物。CRISPR/Cas9系统是利用单链导向RNA（single-guide RNA,sgRNA）识别与之配对的外源靶向基因,并对其进行编辑,从而达到对靶向基因进行突变的目的。但由于存在与靶向编辑基因高度同源的非靶向基因,CRISPR/Cas9系统有时也会错误识别对非靶向基因进行编辑,从而造成脱靶,进而对被编辑的作物具有潜在危害。因此降低CRISPR/Cas9的脱靶率,提高靶向性是目前科学界研究的热点。本实验首先以已完成activase基因编辑的水稻为基础,采用T7核酸内切酶Ⅰ法（T7E1）检测筛选得到编辑成功的子代水稻33株,同时通过软件预测确定可能的脱靶位点11个,T7E1检测法检测基因编辑成功的子代水稻在上述11个脱靶位点是否存在脱靶,初步估算脱靶率为21.21%。为扩大数据量,提高预测的准确性,本研究选择酵母杂交系统进一步研究脱靶率以及研究sgRNA的长短对脱靶率的影响。首先,将含有靶向基因的标准sgRNA（standard sgRNA）和短sgRNA（truncated sgRNA）分别克隆至CRISPR/Cas系统表达载体pDW3766中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,分别转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;在上述预测确定的11组脱靶位点序列中选择7组序列:A,B,C,D,E,F,G和靶向序列分别克隆至含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5,pHZ7,pHZ9, HZ11,pHZ13,pHZ15,pHZ17和pHZ19和对应的低拷贝重组载体pHZ6,pHZ8,pHZ10,pHZ12,pHZ14,pHZ16,pHZ18和pHZ20,其中pHZ19和pHZ20是含有靶向序列的重组载体,作为阳性对照。上述重组载体分别转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。重组酵母YpHZ2和YpHZ4分别与重组酵母YpHZ5-20进行杂交,筛选杂交双倍体酵母,挑取双倍体酵母菌落,液体培养大约48h后,在不同时间段48h,72h,96h,120h,144h,168h,192h取样检测mCherry蛋白荧光值。YpHZ2+19和YpHZ2+20杂交菌株（阳性对照）的荧光成像和荧光检测均显示,培养144h～192h时,有明显的荧光产生,实验组YpHZ2+5和YpHZ2+6的结果显示,在培养144h～192h时,有较微弱的荧光产生,表明脱靶发生,其余杂交菌株在相同时间段内未检测到荧光。综上所述,本研究得到以下结论:（1）CRISPR/Cas9系统可准确识别靶基因PAM邻近序列（＜10nt）,但同时如果脱靶序列与靶向基因序列同源性越高,越易产生脱靶作用;（2）Truncated sgRNA序列在一定程度上可提高CRISPR/Cas9的靶向性,降低脱靶作用,其结果还需要通过优化实验操作得以验证。
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