油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）和十字花科细菌性黑斑病菌（Pseudomonas syringae pv.maculicola）均为油菜籽上可能携带的检疫性有害生物,近年来我国每年大量进口油菜籽,病菌随带菌油菜籽传入的风险极大。本研究针对进口油菜籽上携带的油菜茎基溃疡病菌和十字花科细菌性黑斑病菌进行了分离鉴定,并针对上述2种病菌建立了含扩增内标的多重实时荧光PCR检测方法,此外还针对十字花科细菌性黑斑病菌建立了基于PMA-qPCR的活菌检测方法。主要的研究结果如下:（1）从进口油菜籽中收集疑似染病样品,采用特异性引物进行PCR检测;将筛查为油菜茎基溃疡病菌阳性的样品于PDA上分离培养,菌落白色平坦,边缘呈现不规则状,显微镜下观察气生菌丝多而紧密,菌丝短小且分支较多;分生孢子器球形至扁球形,褐色至深褐色,散生、埋生或半埋生于菌丝中,培养25天左右分生孢子器成熟会从孔口处溢出浅粉红色胶质状粘液;采用特异性引物PCR检测,显示为油菜茎基溃疡病菌阳性;通过ITS基因序列的系统发育分析,与已知的油菜茎基溃疡病菌聚在同一簇,人工接种油菜幼苗能引起典型症状,表明分离菌株确为油菜茎基溃疡病菌（L.maculans）。（2）从进口油菜籽中收集疑似染病样品,采用特异性引物PCR检测,将十字花科细菌性黑斑病菌阳性的样品于MT培养基上进行分离培养,菌落培养3～4天时呈米白色,直径小于1 mm,圆形至椭圆形,表面干扁,周围无透明水解圈;培养4d～7d后,菌落周围出现小而模糊的吐温80水解圈;采用特异性引物PCR检测,显示为十字花科细菌性黑斑病菌阳性;通过选择6个看家基因gyr B、rpo D、glt A、gap1、acn B和pgi进行多位点序列分析,系统发育树显示分离菌株与已知的十字花科细菌性黑斑病菌聚在一起,人工接种油菜幼苗能引起典型症状,表明分离菌株确为十字花科细菌性黑斑病菌（P.syringae pv.maculicola）。（3）人工构建一段随机序列作为扩增内标（Internal amplification control,IAC）,并设计了扩增内标探针,通过对实时荧光PCR体系中各个引物及探针比例的优化,建立了含有扩增内标的十字花科细菌性黑斑病菌和油菜茎基溃疡病菌的多重实时荧光PCR方法。结果显示在20μL的体系中加入1.114×10~3拷贝的IAC不影响靶目标的扩增,该方法具有良好的特异性,对十字花科细菌性黑斑病菌的灵敏度为6.9×10-4ng/μL,对油菜茎基溃疡病菌的灵敏度为1.6×10-4ng/μL;将该方法应用于52批进口油菜籽和十字花科蔬菜种子检测,结果显示该方法不仅可以实现2种检疫性病害的快速检测,且能同时有效指示PCR反应的假阴性,具有较强的使用价值,在提高口岸检测准确性的同时防止了漏检现象。（4）利用叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）与实时荧光PCR技术相结合（PMA-qPCR）,通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行优化,建立一种快速而准确检测十字花科细菌性黑斑病活菌的方法。结果显示当PMA工作浓度为10μg/m L,避光条件下孵育5min、然后曝光10min,此条件下能够完全抑制10~7cfu/m L十字花科细菌性黑斑病死菌的DNA扩增而对活菌扩增无影响;通过对比实时荧光PCR和PMA-qPCR的灵敏度可知,灵敏度与实时荧光PCR的差异不大;应用PMA-qPCR定量方法检测人工感染十字花科细菌性黑斑病菌的油菜籽,最低可检出10~2cfu/g的十字花科细菌性黑斑病菌。将PMA-qPCR方法用于实际5批十字花科细菌性黑斑病菌油菜籽阳性样品检测,结果显示该方法能准确反映实际样品的带活菌的情况,并对风险评估和风险预警提供技术依据。