金针菇漆酶基因家族成员基因结构和表达特性分析

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本研究在金针菇的基因组中注释到1 1个漆酶基因,并对其进行了生物信息学分析。在此基础上,探索了稻草和木屑作为诱导物对金针菇漆酶基因家族的影响,筛选出两个差异表达较明显的基因(lac6、lac7),并对lac6作了真核表达鉴定以及在金针菇各生长发育时期的表达量分析,初步揭示了lac6在金针菇生长发育过程中的功能。本研究结果为金针菇漆酶功能的深入研究提供了理论基础,为金针菇栽培料的优选提供了理论依据。试验主要结果如下:1.对金针菇的两个同核体进行了全基因组测序,根据基因组的注释结果及其与转录组数据进行定位的结果,初步确定了金针菇中含有11个编码漆酶的基因。并通过对11个漆酶的motif和domain进行分析进一步佐证了其准确性。然后对1 1个基因的基因结构、基本理化性质,信号肽等进行了分析。与其他经典的真菌漆酶相同,金针菇漆酶也包含了 4个motif(10个组氨酸和1个半胱氨酸)和3个domain,即Cu-oxidase,Cu-oxidase2和Cu-oxidase3,进一步说明它们属于漆酶。根据系统进化树分析,1 1个漆酶中有8个与其他已提交NCBI的金针菇漆酶基因有很高的同源性,剩下的3个基因各自单独成支,但是结合它们的motif和domain分析,认为这三个基因是新发现的漆酶基因。对1 1个漆酶的信号肽预测结果发现,大多数金针菇漆酶具有信号肽,属分泌蛋白,但是有一个漆酶(lac3)不具有信号肽,说明漆酶也不仅仅是在胞外起作用。2.探究了诱导性的复杂的木质纤维素基质(稻草、木屑)相对于单糖(葡萄糖)在转录水平上对漆酶基因表达的影响。试验结果表明,金针菇的11个漆酶大致分为两类:一类是组成型漆酶。无论其碳源是稻草还是木屑,表达量基本都没有变化,这类基因包括lac2、lac5、lac8、lac9;另—类是诱导型漆酶。当稻草和木屑作为单一碳源时,这类漆酶基因受到不同程度的诱导,表达量呈不同倍数上调。这类基因包括lac1、lac3、lac4、lac6、lac7、lac10、lac11。在这些上调表达的基因中,lac6、lac7上调倍数最高,对诱导物的反应最强。另外,木屑对金针菇漆酶的诱导作用高于稻草。3.成功克隆到金针菇漆酶lac6的cDNA,然后运用甲醇营养型毕赤酵母GS115对lac6进行异源表达,并且分泌的胞外蛋白具有漆酶活性,由此鉴定了lac6确实属于漆酶。4.为了深入探究lac6在金针菇发育的各个时期中的作用,分析了lac6在4个不同发育阶段(菌丝、原基、伸长期、成熟期)和3个不同的组织(菌丝、菌柄、菌盖)的差异表达情况。试验结果显示,lac6在异核体菌丝中的表达量最高,和同核体(W23)菌丝相比,在异核体(H1123)菌丝中的表达量大约上调了 7倍,而在其他阶段的表达量都比较低。由此推测,该基因的表达量与H1123菌丝的生长发育有关。
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