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目的:糖尿病患病率日益增高,其流行趋势已然成为一种全球化的公共卫生问题。根据国际糖尿病联合会公布的2021年最新数据显示,全球成年人糖尿病患病人数约5.36亿人,其中中国糖尿病患病人数已接近1.41亿,患病人数居于世界首位。糖尿病患病率增高的主要原因包括不健康的饮食习惯和生活方式、人口老龄化、环境污染物暴露。糖尿病分为1型糖尿病（Type 1 diabetes,T1D）、2型糖尿病（Type2 diabetes,T2D）、妊娠期糖尿病和以单基因糖尿病为代表的其他特定类型糖尿病。T1D是一种自身免疫性疾病,胰岛β细胞被自身免疫细胞破坏而导致胰岛素的绝对缺乏。T2D是以机体血糖稳态紊乱为特征的慢性代谢性疾病,胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍是T2D发病的重要病理生理学基础。胰岛α细胞和β细胞是构成胰腺内分泌部的主要细胞类型,胰岛α细胞分泌的胰高血糖素是机体主要的升血糖激素;胰岛素由胰岛β细胞分泌,是体内唯一具有降低血糖作用的激素。因此,胰岛α细胞和β细胞在机体葡萄糖代谢以及血糖稳态的调控方面发挥重要作用。胰岛α细胞分泌的胰高血糖素和β细胞分泌的胰岛素是胰岛输出的主要激素。既往研究表明胰岛α细胞功能障碍与糖尿病发展密切相关,胰高血糖素分泌异常导致机体血糖进一步升高,因此加剧糖尿病发展进程。此外,我们已有研究发现核转录因子NF-E2相关因子1（Nuclear factor erythroid-derived 2-like 1,NFE2L1）与胰岛β细胞糖代谢和胰岛素分泌密切相关。Nfe2l1缺失的胰岛β细胞出现糖代谢紊乱;胰岛β细胞特异性Nfe2l1缺失小鼠表现为典型T2D早期症状。然而关于NFE2L1对胰岛α细胞维持机体血糖稳态的影响以及外源应激物导致T2D不同进程中NFE2L1在胰岛β细胞中的具体作用及机制尚无报道。胰岛β细胞特异性毒物链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）和高脂肪饮食暴露是研究糖尿病发生发展过程中胰岛β细胞活性、功能和糖脂代谢的经典模型。因此,本课题构建了胰岛中两种关键细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠模型,即胰岛α细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠和胰岛β细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠进行研究。论文第一部分应用胰岛α细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠模型研究NFE2L1在胰岛α细胞特异性缺失对α细胞功能和血糖稳态的影响;论文第二部分对胰岛β细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠进行高脂肪饮食暴露造模以研究NFE2L1在胰岛β细胞糖脂代谢和T2D发生发展中的作用;论文第三部分应用胰岛β细胞特异性毒物STZ进行造模,探索NFE2L1在外源性毒物致胰岛β细胞损伤中的作用及其机制。基于三个部分的研究内容旨在理清Nfe2l1基因缺失对胰岛主要亚群细胞的代谢、功能和对外来化合物毒性作用反应的影响,进而阐明胰岛组织中转录因子NFE2L1在糖脂代谢稳态调控中的细胞特异性作用,为寻找糖尿病精准防治关键靶点和制定干预策略提供新的实验依据。研究方法:1.胰岛α细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠模型构建和基础生理学指标检测:采用种系为C57BL/6J的Nfe2l1-Flox和Glucagon-Cre小鼠杂交得到胰岛α细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠（Nfe2l1（α）-KO）和对照组Nfe2l1-Flox小鼠。分别对8周龄雌性和雄性Nfe2l1（α）-KO和Nfe2l1-Flox小鼠进行基础生理学指标的动态监测,雄性小鼠每组5只,雌性小鼠每组5-8只。每周检测小鼠体重,每4周检测小鼠体成分,每5周检测小鼠进食和空腹血糖,上述指标监测至小鼠20周龄。动态监测后对雄性小鼠进行腹腔葡萄糖耐量实验和饥饿及再进食处理并检测处理过程中小鼠体重和血糖水平。收取Nfe2l1（α）-KO和Nfe2l1-Flox小鼠胰腺组织进行H＆E染色、免疫荧光染色分析小鼠胰岛形态结构以及胰腺组织中胰高血糖素和胰岛素的表达水平。2.胰岛β细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠高脂肪饮食造模及相关指标检测:胰岛β细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠（Nfe2l1（β）-KO）和Ins2-Cre,Nfe2l1-Flox对照组小鼠由C57BL/6J种系的Nfe2l1-Flox和Ins2-Cre（J003573）小鼠杂交得到。实验采用12周龄雌性Nfe2l1（β）-KO和对照组Ins2-Cre,Nfe2l1-Flox小鼠进行高脂肪饮食暴露15周,每组4-6只小鼠。于高脂肪饮食暴露前检测小鼠体重和血糖水平,暴露过程中对小鼠饮食和饮水量进行动态监测。每周检测小鼠体重,每4周检测体成分。高脂肪饮食暴露后检测小鼠葡萄糖耐量,收取空腹和腹腔葡萄糖注射后的尾静脉血清进行胰岛素含量检测。实验结束收取小鼠眼静脉血浆和各脏器及胰腺组织用于H＆E染色以观察胰岛形态、免疫荧光染色检测胰腺组织中胰岛素和胰高血糖素表达水平以及胰岛细胞增殖水平、透射电镜分析小鼠胰岛β细胞超微结构。应用胰岛素放射免疫分析药盒检测血浆胰岛素含量、应用甘油三酯和游离脂肪酸试剂盒检测小鼠血脂水平。3.体外实验研究Nfe2l1在MIN6胰岛β细胞缺失对β细胞增殖的影响:应用慢病毒转染技术构建Nfe2l1稳定沉默的MIN6胰岛β细胞系（Nfe2l1-KD）。对Nfe2l1-KD和对照Scramble细胞进行基因测序分析,在细胞系和原代胰岛中对GO富集分析中参与细胞增殖过程变化显著的基因进行m RNA表达水平检测。4.胰岛β细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠腹腔注射STZ致胰岛β细胞损伤和糖尿病以及相关指标检测:应用12-14周龄雄性Nfe2l1（β）-KO和对照组Ins2-Cre,Nfe2l1-Flox小鼠进行STZ造模,每组6-9只小鼠。STZ腹腔注射浓度为50μg/g体重,连续注射5天。以STZ腹腔注射的最后一天为第0天,检测相应时间点小鼠体重和血糖,于第15天收鼠,收鼠前检测小鼠葡萄糖耐量。收集造模前和STZ腹腔注射后第15天空腹血浆检测胰岛素含量。实验结束后收取小鼠各脏器并称量其重量计算脏器系数,对胰腺组织进行免疫组织化学染色分析。5.应用原代胰岛和MIN6胰岛β细胞系进行STZ暴露致β细胞损伤造模和相关指标检测:提取12-14周龄雄性Nfe2l1（β）-KO和对照组Nfe2l1-Flox小鼠原代胰岛进行STZ体外造模,每组20个胰岛。原代胰岛经0.5 m M STZ暴露8小时后通过Calcein-AM/PI双染及荧光定量分析以评价胰岛活性。细胞系实验应用MIN6 Nfe2l1-KD和对照Scramble细胞,首先通过细胞形态成像、台盼蓝染色计数、流式细胞术、Calcein-AM/PI双染实验方法评价STZ暴露后的细胞活性。分子生物学实验中分别以不同时间和剂量STZ处理MIN6 Scramble和Nfe2l1-KD细胞后,检测细胞中坏死性凋亡、凋亡、抗氧化相关指标蛋白和m RNA水平。6.体外实验解析Nfe2l1缺失的胰岛β细胞出现对STZ毒性耐受的机制:20 m M糖酵解抑制剂2-DG预处理MIN6 Nfe2l1-KD和Scramble细胞16小时后给予2 m M STZ联合处理8小时,应用Calcein-AM/PI双染及荧光定量分析反应细胞活性,提取细胞蛋白对凋亡通路关键蛋白进行检测。7.统计分析方法:实验数据通过Graph Pad Prism 5.0软件的双因素方差分析（TWO-WAY ANOVA）、单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）、t检验方法进行统计学分析并作图。胰腺组织病理学、原代胰岛和MIN6细胞系的Calcein-AM/PI荧光染色、Western Bolt数据应用Image Pro Plus 6.0和Image J 1.51j8软件进行定量分析。所有实验数据的表示方式均为平均值±标准差（（?）±SD）,P＜0.05代表差异具有统计学意义。结果:1.Nfe2l1在胰岛α细胞特异性缺失对α细胞功能和血糖稳态没有显著影响。分别对雄性和雌性胰岛α细胞特异性Nfe2l1敲除小鼠基础生理学指标检测后发现,Nfe2l1（α）-KO小鼠体重、进食血糖和空腹血糖、体内脂肪总量占比和肌肉总量占比相较于同周龄的Nfe2l1-Flox小鼠没有明显差异。腹腔注射葡萄糖耐量结果表明,葡萄糖注射后相同时间点的Nfe2l1（α）-KO小鼠血糖水平与Nfe2l1-Flox小鼠相比没有显著差异。饥饿再进食过程中Nfe2l1（α）-KO小鼠的体重和血糖水平与Nfe2l1-Flox小鼠相比没有显著差别。胰腺组织H＆E染色结果显示Nfe2l1在胰岛α细胞缺失对胰岛结构和形态没有明显影响。胰高血糖素和胰岛素的免疫荧光染色结果显示,与Nfe2l1-Flox小鼠相比,Nfe2l1（α）-KO小鼠胰腺组织中胰高血糖素和胰岛素表达水平没有明显差别。2.Nfe2l1在胰岛β细胞中特异性缺失加重高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱。在高脂肪饮食暴露过程中,Nfe2l1在胰岛β细胞缺失对小鼠的摄食量和饮水量没有明显影响。与Ins2-Cre和Nfe2l1-Flox相比,Nfe2l1（β）-KO小鼠体重和体脂含量升高更显著（P＜0.05）。高脂肪饮食暴露后Nfe2l1（β）-KO小鼠葡萄糖耐量低于Ins2-Cre和Nfe2l1-Flox小鼠（P＜0.05）,高脂肪饮食暴露加重Nfe2l1（β）-KO小鼠空腹高胰岛素血症、葡萄糖刺激的胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗。H＆E染色及定量分析结果显示,高脂肪饮食暴露导致小鼠胰岛体积增大和数量增多,并且在Nfe2l1（β）-KO小鼠中胰岛体积增大较Ins2-Cre和Nfe2l1-Flox小鼠更明显（P＜0.05）。增殖指标的免疫荧光染色和定量分析显示Nfe2l1（β）-KO小鼠胰岛中增殖的胰岛β细胞数量比Ins2-Cre和Nfe2l1-Flox小鼠显著增多（P＜0.05）。Nfe2l1在MIN6胰岛β细胞稳定低表达导致β细胞中细胞增殖相关生物学过程变化显著,Nfe2l1-KD细胞和Nfe2l1（β）-KO小鼠原代胰岛中细胞增殖相关指标的m RNA表达水平与对照组（Scramble细胞和Nfe2l1-Flox小鼠原代胰岛）相比升高（P＜0.05）。3.Nfe2l1（β）-KO小鼠抵抗胰岛β细胞特异性毒物STZ所致β细胞损伤。体内实验:STZ腹腔注射后Ins2-Cre,Nfe2l1-Flox和Nfe2l1（β）-KO小鼠血糖水平明显升高（P＜0.05）,并且Nfe2l1（β）-KO小鼠在STZ腹腔注射后第7和14天的血糖水平显著低于Ins2-Cre和Nfe2l1-Flox小鼠（P＜0.05）。STZ暴露后Nfe2l1（β）-KO小鼠空腹血浆胰岛素含量高于Nfe2l1-Flox小鼠（P＜0.05）。免疫组织化学染色结果也显示STZ暴露破坏胰岛完整性,减少胰岛β细胞数量,并且与Nfe2l1-Flox小鼠相比,Nfe2l1（β）-KO小鼠胰岛损伤程度减轻、胰岛内功能性β细胞数量更多。体外实验:STZ处理后Nfe2l1（β）-KO小鼠原代胰岛内反应细胞凋亡的PI阳性染色面积占比显著低于Nfe2l1-Flox小鼠胰岛（P＜0.05）。细胞形态成像、台盼蓝染色计数、流式细胞术、Calcein-AM/PI双染实验均显示,在相同STZ处理条件下,MIN6 Nfe2l1-KD细胞活力显著高于对照组Scramble细胞（P＜0.05）。STZ处理导致MIN6胰岛β细胞内凋亡相关蛋白表达水平升高,且具有时间和剂量效应关系。并且凋亡相关蛋白在Nfe2l1沉默的胰岛β细胞中表达水平显著低于对照组细胞（P＜0.05）。应用糖酵解抑制剂2-DG预处理发现,2-DG预处理增加Nfe2l1-KD细胞对STZ诱导细胞毒性的敏感性。结论:1.Nfe2l1在胰岛α细胞特异性缺失对α细胞功能和血糖稳态没有显著影响。2.Nfe2l1缺失的胰岛β细胞中细胞增殖相关基因表达水平升高。Nfe2l1（β）-KO小鼠在高脂肪饮食暴露后β细胞数量增多,进而导致空腹状态下胰岛素分泌增多。Nfe2l1在胰岛β细胞中缺失加重高脂肪饮食诱导的空腹高胰岛素血症、糖脂代谢紊乱和T2D的发生发展。这提示我们胰岛β细胞中的NFE2L1在高脂肪饮食导致T2D的过程中具有重要作用。3.胰岛β细胞Nfe2l1缺失小鼠抵抗STZ诱导的β细胞损伤和高血糖。Nfe2l1缺失的胰岛β细胞对STZ暴露所致细胞凋亡较为耐受,Nfe2l1缺失的胰岛β细胞糖酵解能力增强,进而导致其对STZ诱导的细胞损伤耐受。这说明胰岛β细胞中的NFE2L1在STZ导致β细胞损伤和功能障碍中发挥重要作用。