TLRs信号通路诱导的天然免疫应答在抵抗和清除病原微生物的感染、维持机体免疫系统的稳态方面发挥着重要的作用。然而,如果TLRs信号过度活化将会导致免疫疾病的发生,所以机体内存在着复杂精细的调控机制,适时调控TLRs信号的传递,避免机体发生过强的免疫反应,保持机体的平衡。　　 Noc4L(nucleolarcomplexassociatedprotein4homolog)是本实验室使用酵母双杂交技术,以TLR4胞内段为诱饵蛋白筛选得到的可能与TLR4相互作用的蛋白,初步研究发现其可能具有抑制TLRs信号通路的功能。该蛋白是由516个氨基酸组成的多次跨膜蛋白,且具有保守的Noc结构域,属于CBF/MAK21家族的成员之一,进化上极为保守,然而其生物学功能还完全未知。本课题组发现Noc4L的N端可以与TLR4蛋白C端的TIR结构域相互作用(未发表)。　　 为更好地研究Noc4L的生物学功能,在本实验中,首先对本实验室已有的表达shRNA的p113.7慢病毒载体进行改造,成功构建真核表达载体p113.7-EF1,该载体具有高效、长期稳定表达和免疫原性低的特点,不仅能够表达较高水平的Noc4L蛋白,也为其它目的基因的表达提供了很好的工具。在此基础上构建了稳定表达Noc4L的RAW264.7细胞株,作为研究Noc4L在TLRs介导的信号通路中的调控作用的细胞模型。使用不同配基进行刺激,通过ELISA检测发现Noc4L过表达能有效抑制LPS和poly(I:C)激活的TLRs信号通路中的炎症因子的释放,说明Noc4L很可能参与了TLR4和TLR3介导的信号通路的负调控。但野生型RAW264.7细胞中Noc4L基因的表达并不受LPS刺激的影响。　　 在探讨Noc4L表达抑制对TLRs介导的信号通路的影响的实验中,根据鼠源Noc4LcDNA序列,设计了三种19nt的siRNA,将其构建成shRNA慢病毒载体,包装成慢病毒后感染RAW264.7细胞系,获得稳定释放shRNA的细胞系后,分析了不同靶序列siRNA对Noc4L表达的干扰效果,结果显示所设计的三种siRNA均未能对Noc4L基因进行有效的抑制,目前已经重新设计新的siRNA,实验正在进行中。　　 最后,我们初步探讨了Noc4L蛋白的组织分布和细胞定位。Real-timeRCR结果表明Noc4L广泛表达在小鼠的多种组织中,其表达水平没有显著差异。亚细胞定位研究发现Noc4L蛋白主要定位在细胞膜和其它膜结构的细胞器上,与预测其包含有跨膜区结构特征相符合。然而其它核仁复合物大都定位在细胞核内。这暗示Noc4L可能是一个多功能蛋白,除了参与核糖体加工成熟(根据保守结构域预测),还通过与细胞膜上的TLR复合物相互作用达到对TLRs信号通路的调控。