脑血管病发病率高,严重危害人类健康。脑中风是最常见的危及生命的神经系统疾病,也是当今第二大死亡原因及首位致残原因。脑缺血损伤所致的神经元大量死亡是导致中风后神经功能丧失的主要原因,而目前仍未阐明缺血性脑损伤的机制,在寻找治疗脑中风药物靶点的同时,预防和康复仍是临床上主要的治疗策略。脑缺血导致的脑损伤一般在缺血后数小时至数天发生,尤其在全脑缺血模型,观察到海马CA1锥体神经元损伤发生在缺血后3天左右。而这种脑缺血后神经细胞的延迟性死亡的发生发展涉及多个机制,其中包括凋亡、兴奋性毒性、炎症等。脑缺血中,持续的脑细胞的损伤可导致复杂的炎症级联反应,主要体现在小胶质细胞和星型胶质细胞的活化、白细胞、单核细胞、巨噬细胞的浸润,活化的小胶质细胞释放前炎因子、超氧化物、NO、TNF-α、蛋白酶等神经毒性物质,这些物质都在不同程度地加剧着继发性脑损害。现行认为“炎症”是增强脑缺血后续损害的主要因素之一。因此,抗炎被认为是缓解脑缺血后中枢神经损伤的重要策略之一。中枢神经系统(CNS)最主要的免疫效应细胞小胶质细胞担任着免疫性炎症反应的角色。小胶质细胞过度活化对中枢神经系统可造成过多的病理损害,适当抑制其活化或拮抗其产生的神经毒性分子,能减少进一步的细胞毒作用和病理损害。但干预治疗必需在小胶质细胞活化的早期即组织处于可逆性损伤阶段进行。针对此阶段而探索到众多的抗炎药物均已展示初步的效果。如：胆碱能受体激动剂、糖皮质激素、IL-1拮抗剂、NO抑制剂、中药、免疫抑制剂、抗丝裂原剂、抗生素等。有研究表明Minozac可穿透血脑屏障,且选择性抑制小胶质细胞和星型胶质细胞的活化,从而显著提高老年痴呆鼠的空间学习记忆能力。而ZGF-2-130是Minozac的衍生物。基于以上研究结果,我们采用大鼠全脑缺血模型,探讨ZGF-2-130是否能保护脑缺血后海马神经元迟发性死亡及其机制。本实验中全脑缺血再灌注模型均使用230±20g雄性wistar大鼠,参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血模型。结果发现缺血前2h腹腔注射ZGF-2-130低、中、高剂量组(1mg/kg/次,5mg/kg/次,12.5mg/kg/次,2次/天,给药7天)均有神经保护作用,其中低剂量组海马CA1区神经元存活数目为46.22±5.29个/mm,高于缺血生理盐水组19.40±2.43个/mm,结果有显著差异(P<0.05),与假手术组(277.57±5.48)相比差异显著(P<0.01)。中、高剂量组海马CA1区神经元存活数目分别为109.09±10.99个/mm和97.43±8.70个/mm,为原有神经元数目的39.30%和35.10%,与缺血生理盐水组相比差异显著(P<0.01)此项结果显示,全脑缺血再灌注2h前注射不同剂量ZGF-2-130,均有神经保护作用,且此保护作用有一定的剂量依赖效应。为了观察ZGF-2-130是否能抑制缺血再灌注引起的中枢小胶质细胞炎症反应,我们按上述给药方案和时间,缺血前2h腹腔注射不同剂量的药物后7天,观察海马CA1区小胶质细胞的活性。结果显示：假手术组双侧海马CA1区小胶质细胞(OX-42阳性细胞)反应活性微弱,免疫荧光几乎不可见；缺血生理盐水组双侧海马CA1区活化的小胶质细胞数目最多,免疫荧光最强；而给药低、中、高剂量组均有抑制小胶质细胞的活性,其中、高剂量组抑制效果较明显。为了进一步探讨ZGF-2-130是否影响星型胶质细胞的炎症反应,我们按上述给药方案和时间,缺血前2h腹腔注射不同剂量的药物ZGF-2-130后7天,观察海马CA1区星型胶质细胞的反应强度和数目。结果显示：假手术组双侧海马CA1区星形胶质细胞(GFAP阳性细胞)数目平均为24.49±1.27个/mm2,与缺血生理盐水组(61.80±2.95个/mm2)相比有显著差异(P<0.05)；即在全脑缺血再灌注7天时,海马CA1区星形胶质细胞数目为原有数目的2.72倍；当缺血前2h给予1mg/kg/次、5mg/kg/次和12.5mg/kg/次的ZGF-2-130腹腔注射,2次／天,给药7天观察到大鼠海马CA1区星形胶质细胞数目分别为53.63±3.54个/mm2、54.60±2.74个/mm2和55.80±2.88个/mm2。各给药组和缺血生理盐水组与假手术组相比有显著差异(P<0.01),但缺血生理盐水组和给药组组间无统计学差异(P>0.05)。同时为了证明经ZGF-2-130保护后的神经元是否仍具有功能,我们采用Morris水迷宫行为实验,观察缺血后大鼠空间学习记忆能力的改变,实验在缺血后第9天进行,结果发现,缺血前2h给予5mg/kg ZGF-2-130对大鼠的空间学习记忆有改善的趋势(P=0.07)。然而以上这种预防作用的临床意义不大,因为考虑在中风发作之前给予药物保护似乎不现实,目前临床很难准确预测中风发作的精确时机。因此,需探讨在缺血后不同时间给予该药物,观察其对全脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元迟发性死亡的保护作用。当缺血后30min给予5mg/kg/次,ZGF-2-130腹腔注射,2次/天,给药7天观察到海马CA1区神经元存活数目为67.06±6.75个/mm,显著高于缺血生理盐水组9.384±1.16个/mm,差异显著(P<0.01),为原有神经元数目的24.40%。当缺血后6h给予5mg/kg/次,ZGF-2-130腹腔注射,2次/天,给药7天观察到海马CA1区神经元存活数目为46.21≈4.72个/min,为原有神经元数目的16.81%,与缺血生理盐水组比较差异显著(P<0.01)。可见,全脑缺血再灌注后给予ZGF-2-130腹腔注射,给药时间越早,治疗效果越好。而缺血后30min给予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射,2次/天,给药7天后,假手术组大鼠双侧海马CA1区小胶质细胞(OX-42阳性细胞)数目平均为23.574±1.47个/mm2；缺血生理盐水组大鼠双侧海马CA1区小胶质细胞数目为314.24±8.19个/mm2,即在全脑缺血再灌注7天时,海马CA1区活化的小胶质细胞数目为原有数目的13.33倍；而给药组大鼠,海马CA1区小胶质细胞数目为197.25±7.91个/mm2,为原有小胶质细胞数目的8.4倍,即海马CA1区小胶质细胞反应性增多减少了4.96倍；当缺血后6h给予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射,2次/天,给药7天观察到大鼠海马CA1区小胶质细胞数目为236.51±7.71个/mm2,为原有小胶质细胞数目的10.03倍,即海马CA1区小胶质细胞反应性增多减少了3.3倍。可见,在全脑缺血再灌注模型中,海马CA1区小胶质细胞的数目是显著增多的,缺血后不同时间腹腔注射药物ZGF-2-130,给药时间越早,对海马CA1区小胶质细胞数目的抑制作用越明显,至缺血后6h给药,仍有较为明显的抑制作用。由此实验结果可知,ZGF-2-130对缺血再灌注引起的海马CA1区小胶质细胞数目反应性增多有显著的抑制作用。为了进一步验证缺血后给予ZGF-2-130是否影响星形胶质细胞的炎症反应,我们按上述给药方案和时间,观察海马CA1区GFAP阳性细胞的反应强度和数目。结果显示：假手术组双侧海马CA1区GFAP阳性细胞数目平均为31.44±3.09个/mm2,与缺血生理盐水组(68.89±3.02个/mm2)相比有显著差异(P<0.01)；即在全脑缺血再灌注7天时,海马CA1区GFAP阳性细胞数目为原有数目的2.3倍；当缺血后30min给予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射,给药7天观察到大鼠海马CA1区GFAP阳性细胞数目为61.63±4.31个/mm2；而缺血后6h给予5mg/kg/次ZGF-2-130腹腔注射,给药7天观察到大鼠海马CA1区GFAP阳性细胞数目为60.83±2.55个/mm2。与假手术组相比,缺血生理盐水组和给药组显著增多(P<0.05),但缺血生理盐水组和给药组组间没有统计学差异(P>0.05)。同时我们也探讨了ZGF-2-130对海马CA1区GFAP表达的影响,Western bloting结果表明缺血/再灌注后GFAP表达水平上调,与假手术组差别有统计学意义(P<0.01)。缺血/再灌注后30min,6h给药组GFAP蛋白的表达水平分别是假手术组的1.69,1.72倍,差别有统计学意义(P<0.01),但与缺血生理盐水组比较无统计学差异(P>0.05)。结果提示ZGF-2-130对GFAP蛋白表达无影响。由此实验结果可知,ZGF-2-130对缺血再灌注引起的海马CA1区星型胶质细胞炎症反应无显著的抑制作用。为了探讨ZGF-2-130是否影响NOS的活性,缺血后30min和6h,分别给予5mg/kg/次,ZGF-2-130腹腔注射,2次/天,给药7天,结果表明：海马CA1区NADPH黄递酶阳性细胞数目分别为96.61±5.25个/mm和131.10±7.43个/mm,相对于缺血生理盐水组(149.33±5.31个/mm)显著降低(P<0.05),与假手术组(50.71±2.14个/mm)相比均有显著差异(P<0.01)。可见,全脑缺血再灌注后给予ZGF-2-130腹腔注射,给药时间越早,NADPH黄递酶阳性细胞数降低的越明显,对NOS活性的抑制作用越强。为进一步研究ZGF-2-130抑制小胶质细胞的机制,我们检测了ZGF-2-130是否影响海马可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的]mRNA表达。RT-PCR结果表明缺血后3天给药组iNOS的表达降低了39.4%(P<0.05)。为验证体内结果,我们也观察了ZGF-2-130是否对体外培养的小胶质细胞系(BV2)活性和炎症因子产生影响,利用LPS刺激BV2细胞建立炎症模型,首先通过MTT方法观察ZGF-2-130对BV2细胞是否有毒性,结果显示ZGF-2-130在0-20nM对细胞无明显毒性作用,不影响细胞活性；但200nM可致细胞明显毒性,显著降低细胞活性(P<0.01)。同时也观察到正常培养的BV2细胞胞体多数呈梳状或杆状,视野下可见大量细胞伸出突起；LPS(1ug/ml)可刺激BV2细胞胞体增大、突起收缩,细胞多呈球状；MTT结果表明ZGF-2-130(0-20nM)也不影响LPS作用后BV2细胞的活性(P>0.05)。ELISA和RT-PCR结果均显示ZGF-2-130可显著抑制LPS诱导的IL-1p和TNF-a蛋白和]nRNA的表达(P<0.05)。大量研究发现MAPK信号通路与炎症因子的产生密切相关,为了进一步探索ZGF-2-130抑制炎症因子产生的机制,我们利用Western blot观察ZGF-2-130是否影响p38、ERK、JNK激酶活性,在培养BV2细胞上探讨了ZGF-2-130神经保护作用的信号转导机制。结果发现,LPS刺激15min,p38磷酸化水平增高,30min达最高,随后逐渐恢复到正常水平；而JNK激酶的磷酸化水平则在LPS后呈现持续性增加,15min达最高。而给予ZGF-2-130(0.2-20nM)处理后,可显著抑制p38和ERK磷酸化水平,但对JNK激酶的磷酸化水平无显著影响。上述结果提示：ZGF-2-130可能通过抑制p38和ERK活化来抑制炎症因子的产生。综上所述, ZGF-2-130可显著保护缺血性海马CA1区神经元的迟发性死亡；其机制之一可能是通过抑制小胶质细胞p38MAPK、ERK活性,从而降低炎症因子的产生。