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宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。近年来,随着社会生活的变化,宫颈癌发病的年轻化和腺癌比例增加等都给宫颈癌的诊治提出了新的问题和面临着新的挑战。为此,人们致力于探索提高宫颈癌治疗效果的方法。hTERT (human telmoerase reserse transcriptase)是人端粒酶活性的中心,是最重要、最普遍的肿瘤特异性的生化标志之一。端粒酶的活化是细胞永生化和癌变的重要因素。TRAIL (Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand)是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,能选择性介导肿瘤细胞凋亡而对正常组织和细胞无损伤,其抗肿瘤的优势已受到研究者的广泛重视。本实验旨在探讨端粒酶(hTERT)启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对宫颈癌细胞的生长抑制作用,以及与放化疗联合在避免损伤正常细胞,靶向肿瘤及提高特异性治疗中的作用。目的:探讨肿瘤坏死因子相关配体(TRAIL)在宫颈癌组织的表达情况;探讨hTERT启动子调控TRAIL的基因表达载体对宫颈癌细胞株HeLa和SiHa的生长抑制,对细胞生长周期、细胞凋亡等生物学行为的影响;观察联合放化疗对细胞的生长抑制、诱导凋亡的作用以及对细胞成瘤性的影响,进一步探讨hTERT启动子调控TRAIL与宫颈癌的关系,为宫颈癌的治疗及预后提供实验依据。方法:1.应用免疫组织化学方法(SABC),检测49例宫颈癌组织、10例宫颈上皮内瘤变中TRAIL和死亡受体DR4、DR5的表达,及其与宫颈癌的病理分级、临床分期和淋巴结转移的关系。2.用脂质体法转染真核基因表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP和CMVpromoter-pIRES2-EGFP等,G418筛选,将稳定转染的各组细胞组RT-PCR检测TRAILmRNA的表达情况;免疫荧光显微镜观察转染细胞中绿色荧光蛋白GFP/TRAIL的表达情况;流式细胞术检测转染真核表达载体hTERT -TRAIL和CMV-TRAIL对细胞凋亡的作用; MTT法观察转染真核基因表达载体hTERT-TRAIL和CMV-TRAIL对细胞增殖能力的影响;透射电子显微镜观察转染hTERT -TRAIL细胞的超微结构改变。3.采用MTT法,观察转染组细胞对化疗药物顺铂的敏感性及对细胞增殖能力的影响;流式细胞术分析联合化疗药物对转染组细胞的凋亡和细胞周期的作用。4.分别用MTT、流式细胞术观察转染hTERT-TRAIL联合放化疗后,对细胞生长抑制、细胞凋亡和细胞周期的影响;克隆形成能力实验观察转染组细胞联合放化疗后克隆形成的情况。5.用免疫组化法(SABC)检测裸鼠移植瘤组织中TRAIL的表达情况;观察转染真核基因表达载体hTERT-TRAIL的HeLa细胞裸鼠移植瘤成瘤情况及裸鼠生长情况,检测联合放化疗后移植瘤终体积和质量的变化,抑瘤率的变化。结果:1.TRAIL在宫颈癌组织中呈现低表达,与宫颈上皮内瘤变、正常宫颈上皮组表达率三者比较有统计学意义(P <0.05);在不同组织学类型鳞癌与腺癌的表达无统计学意义(P>0.05);在淋巴结转移组呈现低表达,有统计学意义(P<0.05);死亡受体DR4、DR5在宫颈癌组织高表达,有统计学意义(P <0.05)。2. RT-PCR检测端粒酶启动子调控TRAIL基因表达载体TRAILmRNA的表达强于其它组转染细胞的表达(P<0.01);流式细胞仪检测转染hTERT -TRAIL细胞凋亡率显著上调(P<0.05),细胞的恶性增殖能力显著降低(P<0.05);免疫荧光显微镜检测到在宫颈癌细胞株有特异性的绿色荧光蛋白GFP/TRAIL的表达;透射电子显微镜观察到端粒酶启动子调控TRAIL基因表达载体抑制宫颈癌细胞作用是以细胞凋亡为主。3.端粒酶启动子调控TRAIL基因表达载体在体外能抑制宫颈癌细胞的生长,联合化疗增加了化疗的敏感性;抑制作用有时间和剂量依赖性;流式细胞仪检测联合化疗后转染hTERT-TRAIL细胞凋亡率显著上调(P<0.05),对细胞周期的影响以G1/G0期细胞为主。4.与化疗组放疗组相比较,联合放化疗后端粒酶启动子调控TRAIL基因表达载体在体外能明显抑制宫颈癌细胞的生长(P<0.01),诱导细胞的凋亡(P <0.01),化疗放疗具有协同作用。5.免疫组化检测结果显示裸鼠移植瘤组织中有TRAIL的表达;HeLa裸鼠皮下移植瘤成瘤实验表明:与化疗组、放疗组相比较,联合放化疗端粒酶启动子调控TRAIL基因表达载体抑制了宫颈癌细胞HeLa裸鼠移植瘤的生长,其抑瘤率亦明显增加(P<0.05)。结论:1.宫颈癌组织中TRAIL表达下降,与肿瘤的分化、转移密切相关。宫颈癌组织中死亡受体DR4、DR5表达增高,与细胞分化相关。2. hTERT调控的TRAIL可能通过提高宫颈癌细胞株HeLa和SiHa对TRAIL的敏感性,引起宫颈癌细胞株的增殖能力下降,促进细胞的凋亡。3. hTERT调控的TRAIL联合化疗对宫颈癌细胞株HeLa有明显抑制细胞生长、诱导细胞凋亡的作用,同时增加了细胞对化疗的敏感性。4.裸鼠成瘤性实验表明: hTERT–TRAIL对宫颈癌细胞HeLa裸鼠移植瘤的生长有抑制作用,移植瘤质量的抑瘤率提高。5.与单纯放化疗比较,联合放化疗的转染真核基因表达载体hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞株HeLa在体内和体外都有明显的抑制作用。