在蛋白质工程中,通过在蛋白质的特定位点进行拆分或插入新的结构域可构造出不同的调控元件,但如何发现蛋白质中特定的改造位点限制着这些调控元件的构建。因此,找到一种合适的方法来筛选目的蛋白中的改造位点就显得尤为重要。在我们的研究中,我们构建了基于转座子的体外转座反应体系,经优化后能够快速、高效地构建转座子随机插入文库,且构建的随机插入文库满足多样性和均一性的要求。在目的蛋白的选择上,我们将激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)蛋白作为研究对象,AID蛋白的脱氨作用能够实现碱基C→T的特异性突变,利用AID蛋白及其同家族成员的脱氨特性构建的单碱基基因编辑工具能够实现单碱基的精确编辑,由此了解AID蛋白中的插入突变耐受位点对其后续利用有着重要的意义。为此,我们构建了转座子随机插入到AID蛋白中的文库,通过后续的酶切连接分别将(GGGGS)2片段和(EAAAK)2片段插入到AID蛋白中,最终通过基于利福平抗性的鉴定方法筛选出AID蛋白中的两个耐受插入区域:loop7和C端,并在此基础上结合易错PCR和循环富集筛选的策略筛选出了一系列活性较野生型AID蛋白不同程度提高的、带有插入突变的易错PCR突变体,这为后续改造和利用AID蛋白提供了实验基础。