论文部分内容阅读
破骨细胞(osteoclast,OC)是多核高度分化的终末细胞,与成骨细胞(osteoblast,OB)和骨细胞(osteocyte,OST)共同维持骨骼代谢平衡。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是成骨细胞分泌的,抑制破骨细胞分化和活性的细胞因子。OPG能刺激破骨细胞产生自噬,并降低其骨吸收活性。线粒体是细胞能量代谢的重要细胞器,线粒体自噬在维持破骨细胞稳态过程中发挥了关键性的作用,但OPG对破骨细胞线粒体自噬的作用机制鲜有报道。本研究以BALB/c小鼠骨髓单核巨噬细胞分化形成的破骨细胞为研究对象,通过自噬抑制剂CQ、激动剂RAP、线粒体分裂抑制剂Mdivi-1和OPG处理,利用分子生物学等技术手段检测线粒体形态与功能、线粒体分裂和线粒体自噬相关蛋白的表达,研究PINK1/Parkin通路在OPG调控破骨细胞线粒体自噬中的作用机制,为临床应用OPG治疗骨代谢疾病提供科学的理论依据。1.OPG对破骨细胞线粒体功能与形态的影响为了揭示OPG对破骨细胞线粒体功能和形态的影响,本研究通过不同浓度(0、20、40、80 ng·mL-1)OPG处理细胞3 h,或CQ和RAP分别预处理30 min和1 h,再添加40 ng·mL-1 OPG处理细胞3 h后,利用流式细胞术检测破骨细胞活性氧、线粒体膜电位水平,酶标仪检测ATP含量,透射电镜观察细胞线粒体超微结构。结果发现,与对照组(Con)相比,OPG处理使细胞内ROS水平显著降低(P<0.05),而与OPG组相比,CQ+OPG组的ROS水平极显著上升(P<0.01)。与Con组相比,OPG显著降低了 OC内的线粒体膜电位水平(P<0.05),与OPG组相比,RAP和OPG组极显著抑制膜电位水平(P<0.01)。与Con组相比,OPG极显著升高破骨细胞内ATP含量(P<0.01),而RAP+OPG较OPG组ATP含量极显著降低(P<0.01)。OPG诱导破骨细胞线粒体态肿胀,可见线粒体自噬体形成,RAP可以增强OPG对线粒体自噬的促进效果。说明OPG影响破骨细胞线粒体功能和形态,并促进了破骨细胞内线粒体自噬体的形成。2.OPG对破骨细胞线粒体分裂的影响为了阐明OPG对破骨细胞线粒体分裂的影响,本研究通过线粒体分裂抑制剂Mdivi-1和OPG单独或联合处理破骨细胞,采用透射电镜观察破骨细胞线粒体分裂,免疫荧光观察细胞p-Drpls616和线粒体探针Mito tracker Red共定位,Western blot检测线粒体分裂-融合相关蛋白Drp1、Fis1、MFF和Mfn2的蛋白表达水平。结果发现,与Con组相比,OPG引起线粒体肿胀,呈点状的线粒体增多;与OPG组相比,Mdivi-1+OPG组长管状线粒体增多。与Con组相比,OPG增强p-Drp1s616和线粒体的荧光强度,并且呈显著共定位。与Con组相比,OPG极显著上调MFF、Fis1、mito-Drp1和cyto-Drp1蛋白表达水平(P<0.01),并且Drp1向线粒体移位,而Mfn2表达水平显著下调(P<0.05);与OPG组相比,Mdivi-1+OPG极显著抑制线粒体分裂相关蛋白的表达(P<0.01),而极显著促进Mfn2的表达水平(P<0.01)。说明OPG促进破骨细胞线粒体分裂。3.PINK1/Parkin通路在OPG调控破骨细胞线粒体自噬过程中的作用为了探究PINK1/Parkin通路在OPG调控破骨细胞线粒体自噬中的作用,本研究利用Western blot 检测 PINK1、Parkin、VDAC1、Mfn2、TOMM20 蛋白的表达水平,免疫荧光检测 Parkin、TOMM20 和 ubiquitin(Ub)的荧光强度,以及 LC3、Mito tracker Red 和 LAMP2的共定位,免疫沉淀检测Mfn2与Ub的相互作用。结果发现,与Con组相比,OPG显著上调PINK1、Parkin蛋白的表达水平(P<0.05),显著上调VDAC1和TOMM20蛋白表达(P<0.05),下调Mfn2表达水平(P<0.05)。OPG增强Parkin和Ub荧光强度,Parkin和TOMM20的荧光强度,并且LC3、线粒体和LAMP2出现共定位。Mfn2与Ub存在一定相互作用,并呈剂量效应。说明OPG可以通过PINK1/Parkin通路显著增强破骨细胞线粒体自噬水平。