糖尿病是一组以血糖水平增高为特征,由胰岛素分泌或作用缺陷所引起的的代谢性疾病。糖尿病慢性并发症累及全身多个组织器官,包括心血管系统、神经系统、肾脏、肝脏、骨骼肌等。糖尿病肾病和糖尿病非酒精性脂肪肝是糖尿病常见的渐进性并发症。尽管目前治疗糖尿病并发症的方法很多,但糖尿病性肾病和糖尿病非酒精性脂肪肝的发病机理仍然不确定,而且整体的机制复杂。因此,开发新的药物尤为重要。中医强调整体观念、辨证施治,通过复方配伍用药进行个体化治疗,其多脏器、多靶点、系统性调节全身内分泌代谢,符合机制复杂的糖尿病肝肾损伤的治疗。目的中医理论认为肝与肾的关系密切,糖肾方可以改善糖尿病肾病大鼠的肾损伤,但对肝脏的保护作用还未见报道。本研究以链脲佐菌素(STZ)加高脂喂养诱导的2型糖尿病大鼠和自发性2型糖尿病db/db小鼠为研究对象,在验证糖肾方药物作用基础上,探讨糖肾方多脏器、多靶点、系统调理防治糖尿病肝肾损伤的作用及其机制,为临床应用提供理论依据。方法1.采用高脂饲料喂养和小剂量链脲佐菌素腹腔内注射方法,建立2型糖尿病大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为正常对照组、模型组和糖肾方组。每4周动态观察大鼠一般状态、体重、血糖、尿微量白蛋白/肌酐,第20周实验结束时动物取材。(1)糖肾方对糖尿病大鼠肾损伤的保护作用：评价肾小球系膜基质百分比和肾小管损伤指数的病理变化；采用免疫组化法检测肾组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、MCP-1、IL-1β、TGF-β1的表达；RT-PCR方法测定肾组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、MCP-1、IL-1β、LOX、ABCA1、RXR-α、RXR-β、TGF-β1mRNA的表达；Western Blot方法检测肾组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、p-Smad3、p-p65蛋白的表达。(2)糖肾方对糖尿病大鼠肝损伤的保护作用：检测血清中ALT和AST含量。测定肝组织氧化应激指标及脂代谢指标：SOD、CAT、VE、NO、NOS和TG水平。肝组织HE染色,油红O染色后评价肝脏组织脂肪病变程度。2.采用自发性2型糖尿病模型db/db小鼠和同周龄不发病db/m小鼠,随机分为db/m组、db/db组和db/db+TSF组。每4周动态观察小鼠一般状态、体重、血糖、24h尿蛋白,第12周实验结束时动物取材。(1)糖肾方对db/db小鼠肾损伤的保护作用：检测血清中CHO和LDL-C的含量。PAS染色并统计肾小球系膜基质百分比。(2)糖肾方对db/db小鼠肝损伤的保护作用：糖肾方对db/db小鼠肝损伤的保护作用：检测血清中ALT和AST含量。测定肝组织氧化应激指标及脂代谢指标：SOD、MDA、CAT、GSH、GSH-Px、VC、CHO和HL水平。肝组织病理染色后评价肝脏组织脂肪病变程度。结果1.糖肾方可改善对链脲佐菌素加高脂喂养诱导的2型糖尿病大鼠肾损伤,其机制与抗炎、降脂和抗肾纤维化有关。模型组从实验第3周起到第20周结束,体重显著低于正常对照组,糖肾方组大鼠体重较模型组无显著性差异；模型组大鼠血糖及血清TG、CHO和LDL-C水平显著升高,糖肾方组能显著降低模型大鼠的血脂水平,但对模型大鼠的血糖无明显影响；模型组大鼠尿微量白蛋白/肌酐从实验第4周起到20周结束时均明显升高,并在20周时差异达到最大值,糖肾方组从实验第4周到20周结束显著降低模型大鼠尿微量白蛋白/肌酐比值。模型组大鼠肾小球系膜基质百分比和肾小管损伤指数显著高于正常对照组,糖肾方组可明显降低肾小球系膜基质百分比和肾小管损伤指数。免疫组化结果显示,模型组Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、MCP-1、IL-1β、 TGF-β1较正常对照组显著升高,糖肾方组可使Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、MCP-1、IL-1β、 TGF-β1表达明显降低。RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,模型组Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、MCP-1、IL-1β、TGF-β1、LOX mRNA表达明显升高,ABCA1、RXRα和RXRβmRNA显著降低；糖肾方组能显著抑制模型大鼠肾组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、MCP-1、IL-1β、TGF-β1和LOX mRNA表达,升高ABCA1、RXRα和RXRβ mRNA表达。Western Blot结果显示,模型组MCP-1、IL-1β、Smad3、p-p65蛋白表达均显著升高,糖肾方组能显著抑制模型大鼠肾组织MCP-1、IL-1β、Smad3、 p-p65蛋白表达。2.糖肾方可改善对链脲佐菌素加高脂喂养诱导的2型糖尿病大鼠肝损伤,可能与改善肝脏中氧化应激损伤有关。模型组大鼠血清ALT和AST水平明显高于正常对照组,糖肾方大鼠可显著降低模型大鼠ALT、AST水平。与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织匀浆中SOD. CAT、VE水平明显降低,NO、NOS水平升高；糖肾方组大鼠可升高模型大鼠肝组织中SOD、CAT、VE水平,降低NO、NOS水平。HE染色和油红O染色发现,糖肾方组较模型组大鼠肝细胞脂肪变性明显减少,肝细胞排列基本规则。3.糖肾方可改善糖尿病db/db小鼠肾损伤。db/db组从实验第0周起到第12周结束,体重显著高于db/m组,db/db+TSF组小鼠体重从第6周起较db/db组显著升高并持续至实验结束；db/db组小鼠血糖及血清CHO和LDL-C水平显著升高,db/db+TSF组能显著降低db/db小鼠的血脂水平,但对db/db小鼠的血糖无明显影响；db/db小鼠24h尿蛋白从实验开始起到12周结束时均明显升高,并在12周时差异达到最大值,db/db+TSF组从实验第8周到12周结束显著降低db/db小鼠24h尿蛋白。与db/m组比较,db/db组小鼠肾小球系膜基质百分比显著高于db/m组,db/db+TSF组可明显降低db/db小鼠肾小球系膜基质百分比。4.糖肾方可改善糖尿病db/db小鼠肝损伤。db/db组小鼠血清ALT和AST水平明显高于正常对照组,db/db+TSF组小鼠可显著降低db/db小鼠ALT、AST水平。‘与db/m组相比,db/db组小鼠肝组织匀浆中SOD、CAT、GSH、GSH-Px和VC水平明显降低,MDA、CHO和HL水平升高；db/db+TSF组小鼠可升高db/db组小鼠肝组织中SOD、CAT、GSH、GSH-Px和VC水平,降低MDA、CHO和HL水平。HE染色和油红O染色发现,db/db+TSF组较db/db组小鼠肝组织结构清晰,肝细胞脂肪变性和炎症明显减少。结论1.糖肾方能够降低链脲佐菌素加高脂喂养诱导的2型糖尿病大鼠和自发性2型糖尿病db/db小鼠尿蛋白的排泄,纠正脂代谢紊乱,改善肾组织病理损伤,对2型糖尿病肾损害有较好的治疗效果。2.糖肾方保护2型糖尿病肾损伤的机制可能与其抑制炎症(下调肾组织中MCP-1、IL-1 mRNA和MCP-1、IL-1、p-p65蛋白),改善脂代谢紊乱(下调LOX-1 mRNA,上调ABCA1、RXRa和RXR(β mRNA),减轻肾纤维化(下调Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TGF-β mRNA和下调Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TGF-β、Smad3蛋白)有关。3.糖肾方可显著改善2型糖尿病大鼠和db/db小鼠肝功能,降低血脂,改善肝组织病理损伤,减轻2型糖尿病NAFLD病变,可能与其减轻氧化应激损伤,保护肝脏的作用有关。