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目的 线粒体基因(mtDNA)突变会引起很多疾病,比如线粒体基因突变糖尿病(MIDD)。目前MIDD的临床治疗相当困难,人们积极探索新的治疗手段,采用RNA干扰技术、锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)等基因敲除手段来纠正基因突变。目前中医治疗线粒体糖尿病的方法为扶正固本以促进生理机能的恢复,达到正复邪退治疗疾病的目的。实验中改造TALEN为定位到线粒体的mtTALEN,达到对MIDD相关NIT-1细胞突变株突变基因ND4敲除的目的。方法 1.利用同尾酶XbaI-NheI偏单元策略,构建了包含92个质粒的一、二、三单元库作为普通或高通量组装中央重复单元的基础模块,用于mtTALEN系统的质粒库。2.将普通TALEN表达载体架NLS删除,取代以HIV-rev-NES和OTC蛋白MTS,改造TALEN表达载体,使其成为定位到线粒体的mtTALEN。通过免疫荧光和免疫印迹得到方法进行线粒体定位的检测。3.根据线粒体突变糖尿病相关NIT-1突变细胞株的突变基因ND4序列,设计中央重复单元区(CRD)的模块并先后连接组装到克隆载体pUC19上。将克隆载体上中央重复单元区组装的模块插入mtTALEN表达骨架,能特异性的敲除ND4基因。通过转染试剂将其转入NIT-1线粒体突变细胞中,37℃,5%CO2培养箱中孵育48 h,细胞提取基因组进行PCR扩增,通过SpeI单酶切后电泳图及北京华大基因公司测序观察基因敲除结果;基因敲除后的细胞继续培养,挑单克隆,建立稳定细胞系。结果 1.成功构建了 mtTALEN系统质粒库,包括三个单元,共计92个质粒;2.TALEN表达载体改造成mtTALEN载体后能准确的定位到线粒体。3.将mtTALEN质粒对转染到NIT-1线粒体突变细胞中,37℃,5%CO2培养箱中孵育48 h,未检测到突变的ND4基因,证实mtTALEN能够成功敲除线粒体糖尿病的突变基因。结论 根据现有的TALEN系统进行改造,成功构建了一种能敲除线粒体糖尿病相关NIT-1突变的ND4基因的mtTALEN系统,它作为一种基因剪切工具,具有治疗线粒体基因突变疾病的潜在可能性。