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目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有高度增殖、自我更新能力,可向三个胚层的细胞分化[1],在机体组织损伤修复过程及细胞移植治疗等多个领域有广阔的应用前景。目前已有干细胞移植成功治疗炎症性肠病的报道[2],但其在消化道分布定位情况及治疗机制仍不明确。本实验拟①制作、比较大鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型;②分离、培养、扩增、荧光标记大鼠BMSCs,观察其生物学特性;③观察标记的同种异体BMSCs经静脉移植后不同时间在UC及正常大鼠主要器官、消化道各段的分布情况:结肠内BMSCs是否明显多于消化道其余各段?溃疡病灶处BMSCs是否明显多于非溃疡部位?移植BMSCs后是否结肠病变修复优于非移植组?EGF能否促进BMSCs向溃疡部位迁移?为BMSCs在消化管组织工程以及肠黏膜损伤性疾病治疗研究中的应用,提供基础理论和实验依据。第一部分溃疡性结肠炎大鼠模型的建立与比较1材料与方法SD大鼠64只,随机分为:Ⅰ组(免疫+TNBS/乙醇)和Ⅱ组(TNBS/乙醇)各24只,Ⅲ组(乙醇)12只,Ⅳ组(生理盐水)4只。参照文献制作模型,于造模后第1、21天,第8周、12周处死大鼠,剖取全部结肠及回肠末段观察:①大体形态及结肠黏膜损伤情况;②光镜下结肠黏膜损伤;③免疫组化检测不同模型组肠壁组织表达TNF-α和IL-10的情况。2结果2.1肉眼及光镜显示:Ⅰ、Ⅱ组均出现糜烂、溃疡等典型UC结肠病变,Ⅰ组还伴有末段回肠病变;Ⅰ组的病变可维持8周,Ⅱ组病变3周后趋向愈合。Ⅲ组病变仅黏膜充血水肿和少量糜烂或浅表溃疡,第21天痊愈。Ⅳ组未见组织损伤。2.2免疫组织化学染色结果经图象分析显示:成模期内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组结肠黏膜TNF-α表达高于正常对照的Ⅳ组,IL-10低于正常对照的Ⅳ组,差异均有统计学意义(P<0.01)。第二部分骨髓间充质干细胞的生物学特性与标记1材料与方法1.1取4-6周SD大鼠的股骨、胫骨骨髓,分离、培养、扩增获取BMSCs。检测BMSCs的贴壁率、生长曲线;流式细胞仪检测第3和第5代(P3和P5)BMSCs表达CD44、CD45和CD90的情况,以及细胞周期分析。1.2 Hoechst33342 (HCT)荧光标记P3-BMSCs后,不同时点荧光显微镜观察计算标记率。常规冻存复苏BMSCs,观察其生长情况。2结果2.1分离、培养的原代细胞易于贴壁,平均活细胞率为95.6±1.4%。培养3~12d,细胞数量迅速增多,具有典型的长梭状的形态及漩涡状排列的特征。传代BMSCs的生长快于原代细胞;P3～P5 BMSCs的生长滞留期约为24~48h,对数增殖期约为3~6d,7~8d后进入平台期;在含10%FBS的DMEM-F12培养基中每传代一次,细胞增加约2.2倍;6代后细胞出现形态异常的衰老征象。冻存的BMSCs复苏后生长较慢,复苏传代后可恢复至未冻存前传代细胞的生长状态。2.2流式细胞仪检测P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。CD44、CD90的均一性分别为98.26±0.48%及98.68±0.32%。细胞周期检测G0/G1期细胞约为90.81%,S+M+G2期为9.12%。2.3 HCT荧光标记后的BMSCs生长正常,标记率随时间延长缓慢减弱,4周后仍有约90% BMSCs可观察到荧光。第三部分骨髓间充质干细胞移植修复溃疡性结肠炎的作用1材料与方法1.1 SD大鼠60只随机分为A、B、C和D组,每组15只。A、B、C组以免疫+TNBS/乙醇复合法建立UC模型。制备HCT荧光标记的P3～P5 BMSCs悬液备用。模型制备完成后24 h内,4组大鼠均经尾静脉注射1ml不同液体:A组为生理盐水的移植对照组;B组为荧光标记的BMSCs悬液(1×106)的移植组;C组为含300μg EGF的荧光标记BMSCs悬液(1×106)的移植组;D组为荧光标记的BMSCs悬液(1×106)的模型对照组。1.2移植后第3、7、14天各处死5只,解剖观察结肠病变。取B、C和D组的骨髓、肺、肝、脾和消化道组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察荧光标记的BMSCs在骨髓、肺、肝、脾、食道、胃、小肠和结肠内的分布。并检测各组各时间点切片随机10个20倍物镜视野上的荧光积分光密度(integrated optical density, IOD)值,观察其在各器官、组织间的数量差异。1.3取A、B、C和D组的结肠制成HE染色石蜡切片,观察结肠组织的光镜下的溃疡病变。另取结肠石蜡切片经免疫组化染色后观察TNF-α和IL-10的表达。2结果2.1 HCT标记细胞在肺、肝、脾、骨髓分布有一定时间规律性:肺、肝、脾的荧光IOD值7d>3d>14d,骨髓的荧光IOD 7d >14d >3d;第3、7d肺的荧光IOD值和第14d时骨髓的荧光IOD值略高于其他器官;同一器官同一时间点各组荧光IOD值的差异无统计学意义。2.2移植第3、7、14d,B、C和D组食道、胃及小肠的黏膜层均可见标记的BMSCs,同一器官同一时间点各组荧光IOD值的差异无统计学意义。2.3移植第3d,各组结肠与同组食管、胃及小肠荧光IOD值的差异无统计学意义;移植第7、14d,B、C组结肠的荧光IOD值高于同组食道、胃及小肠(P< 0.05);移植14d,B、C组结肠的荧光IOD值高于D组(P<0.05),B和C组间结肠的荧光IOD值的差异无统计学意义。2.4镜下观察,标记的BMSCs主要见于各移植组各时间点的结肠黏膜层,偶见于黏膜下层及肌层。第14d,B、C组结肠病变部位的BMSCs最多,黏膜糜烂和溃疡坏死病灶均可见较多BMSCs,在溃疡周边黏膜层略多于非病变部位结肠黏膜。2.5 A、B和C组结肠炎症及溃疡表现为全结肠性,可见黏膜充血、水肿、上皮细胞坏死脱落、大量炎症细胞浸润及溃疡。D组结肠无异常。移植后第14d,B和C组大鼠结肠黏膜损伤修复程度明显优于A组,B和C组大鼠结肠黏膜损伤修复程度无明显差异。2.6移植后第3、7、14d ,A、B、C组结肠黏膜TNF-α表达高于D组,IL-10低于D组,差异均有统计学意义(P<0.01);第14d, B、C组TNF-α表达低于A组,而IL-10高于A组,差异均有统计学意义(P<0.01);B、C组TNF-α和IL-10表达的差异无统计学意义。全文结论1. 3种UC大鼠模型中,以免疫复合法所建模型为较理想的UC动物模型。2.用贴壁筛选法,成功分离得到大鼠BMSCs,流式细胞仪分析培养P3、P5 BMSCs具有MSCs的表面标记特征,也具有干细胞的细胞周期特点;传代BMSCs的生长较原代细胞快,在含10%FBS的DMEM-F12培养基中每传代一次,细胞增加约2.2倍;冻存对BMSCs的生长无明显影响;P6 BMSCs出现衰老征象。3. Hoechst33342荧光标记BMSCs是短期示踪细胞的有效手段。4.移植的BMSCs在体内广泛分布,在7d的肺14d的骨髓中含量略高于肝和脾,提示移植14d时,多数干细胞仍在血循环中。5.移植的BMSCs 3d即可迁移至结肠,多定居于黏膜层。移植后14d病变结肠BMSCs较其余消化道、以及正常结肠多,病变结肠黏膜层BMSCs较正常结肠黏膜多,提示BMSCs可向损伤组织定向迁移。6.移植BMSCs后14d,移植组结肠黏膜损伤修复程度明显优于非移植组,提示BMSCs移植可修复或促进损伤结肠组织修复。7. BMSCs移植UC大鼠IL-10表达增高而TNF-α表达降低,表明移植的BMSCs可能通过调节肠道TNF-α、IL-10等炎症细胞因子达到免疫平衡来修复UC结肠病灶。8. BMSCs移植组与BMSCs+EGF联合移植组的BMSCs在消化道各段以及结肠病变部位或周边的分布、炎症因子的表达上均无明显差异,提示单次注射EGF无促进BMSC向损伤部位迁移及损伤修复的作用。