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目的探讨氨基酰化酶(Aminoacylase 1,ACY1)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的调控机制,探究ACY1通过调控mTOR信号通路对细胞自噬的作用,阐述ACY1通过影响p62与mTOR的互作从而介导mTOR在溶酶体上定位的分子机制,揭示ACY1通过影响mTOR信号通路对肿瘤细胞生长的调节作用。内容本文将探讨1.ACY1通过调控mTOR信号通路影响细胞自噬的分子机制。2.游离的乙酰化氨基酸对mTOR信号通路的调控。3.ACY1通过影响p62的表达从而介导mTOR在溶酶体的定位。4.ACY1对肿瘤细胞的增殖和活性以及代谢的影响。方法1.利用CRISPR/Cas9技术在HepG2、He La细胞中建立ACY1敲除或敲低的稳定细胞系和相应的对照细胞系。分别在ACY1敲除或敲低及相应对照组的HepG2和He La细胞系中,通过对照处理或EBSS饥饿、是否添加溶酶体抑制剂BAF1处理4小时,利用Western Blot检测自噬相关蛋白(p62、LC3-I及LC3-II)和mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化的核糖体蛋白S6激酶(p-P70S6K)等mTOR通路相关蛋白的表达水平;将上述细胞分别进行同样的处理(饥饿与不饥饿,BAF1处理4小时),利用细胞转染技术将RFP-GFP-LC3双荧光质粒导入上述细胞中,并用DAPI染细胞核,在共聚焦显微镜下观察荧光变化(自噬流变化)判断LC3-I与LC3-II的比例。2.利用细胞转染技术将WT-ACY1-HA质粒和HA对照质粒分别导入到ACY1敲低的HepG2细胞和ACY1敲除的He La细胞中进行恢复实验,获得ACY1敲入表达细胞系,通过Western Blot检测自噬相关蛋白、mTOR、p-mTOR、p-P70S6K的表达水平。3.p62是mTOR信号通路的关键调控因子,是mTORC1(mammalian Target Of Rapamycin Complex-1)复合体的重要组成成分,对mTOR转移到溶酶体并被激活具有有重要调控作用。因此我们在上述提及的细胞系中,分别饥饿1小时后加谷氨酸(800μM)刺激,取1/20裂解液作为Input组,剩余的裂解液与抗体p62于4℃进行抗原抗体孵育6h后与活化的protein A/G珠子混匀过夜,次日将protein A/G混匀液于4℃,1000X g离心5 min,重复清洗protein A/G珠子8次,将所得沉淀用6X loading buffer重悬后于100℃煮10 min,取Input组和IP组样品,利用p62、mTOR抗体检测p62与mTOR的相互作用是否变化;同时在上述细胞中进行同样的处理后,通过免疫荧光技术标记内源的p62与mTOR、内源mTOR与溶酶体标记蛋白LAMP2,检测敲除ACY1后,p62是否会与mTOR的相互作用增强,促进mTOR定位到溶酶体上并导致mTOR信号激活;在上述两种细胞系中,分别氨基酸饥饿与氨基酸饥饿2 h后加乙酰化氨基酸及游离氨基酸各800μM的浓度处理2小时,利用Western Blot技术检测mTOR、p-mTOR相关蛋白的变化。4.为了检测ACY1是否对细胞代谢以及细胞增殖的影响,我们在HepG2细胞敲低ACY1后通过Sea-horse海马实验检测线粒体氧化呼吸以及糖酵解等分解代谢水平;选取生长状态良好的ACY1-KO-He La和ACY1-NC-He La细胞系,消化细胞并计数,96孔板中每孔接种1x 10~5个细胞,在细胞培养箱中培养72小时,然后检测450 nm波长处的吸光度;在96孔板中接种上述细胞悬液,待细胞长到90%左右的密度且状态良好时,分别经EBSS饥饿处理,然后于0,12,24,36,48h时间梯度用CCK8实验来检测细胞活力。结果1.运用CRISPR/Cas9技术获得ACY1-KD-HepG2和ACY1-KO-He La稳定细胞系,两种细胞系通过饥饿与不饥饿处理后,结果表明:ACY1敲低或敲除细胞与对照组细胞相比,p62表达增加,LC3-I减少,LC3-II变化不明显,p-mTOR与p-P70S6K都相应增加;在上述细胞中转入RFP-GFP-LC3双荧光质粒后进行饥饿和加药处理,通过共聚焦显微镜观察到敲低或敲除ACY1基因后,LC3亮点明显减少,而且红光与绿光叠加后基本没有红点,自噬流减少;综上所述说明敲低或敲除ACY1后抑制自噬的基础水平。2.分别向ACY1-KD的HepG2细胞和ACY1-KO的He La细胞转入HA和HA-ACY1质粒进行恢复实验,结果表明重新导入ACY1后,P62表达降低,LC3-II增多,p-mTOR和p-P70S6K都相应降低。3.分别在ACY1敲除或敲低的细胞补充乙酰化谷氨基酸及普通谷氨基酸后观察对mTOR信号通路的影响,结果表明乙酰化谷氨基酸相比于普通氨基酸刺激,p-mTOR增多,激活mTOR信号。4.在上述提及的细胞系中分别饥饿1 h后加谷氨酸(800μM)刺激,用p62抗体共沉淀内源的p62蛋白,检测p62、mTOR蛋白水平,结果显示:在饥饿条件下,敲除ACY1后,input组p62与mTOR显著增多,用内源的P62可以与内源的mTOR互作,且敲低ACY1后内源p62与mTOR的相互作用明显增强;上述的细胞进行同样的处理后,通过共聚焦显微镜观察到敲低ACY1基因后,mTOR与p62的共定位增多,mTOR与溶酶体的共定位也增多;说明敲低ACY1后通过影响p62与mTOR的相互作用从而介导mTOR在溶酶体上定位增多。5.敲低ACY1后,细胞的分解代谢能力降低;在HepG2细胞中敲低ACY1后,细胞的糖酵解能力、氧化呼吸代偿能力、ATP产生能力都相应降低。6.在He La细胞中敲除ACY1后,能促进细胞增殖并且在饥饿应激条件下提高细胞的存活率。结论1.敲除ACY1后,细胞通过激活mTOR信号抑制细胞的基础自噬水平。2.ACY1的敲低影响p62与mTOR的相互作用,促进mTOR在溶酶体上的定位及激活。3.ACY1的缺失导致细胞的分解代谢能力降低以及肿瘤细胞增殖能力增强。