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ZFY (zinc finger-Y)基因是从Y染色体上分离而来,它是在寻找Y染色体上促雄性发育基因时发现的第一个基因,并被认为是可能的睾丸决定因子,其编码的蛋白质通过一个“锌指”结构域与DNA结合,从而调控其他基因的表达,在精子的发生过程中发挥着重要作用。早期为了验证ZFY基因是最主要的睾丸决定因子这一假设,研究内容大都聚焦于性腺发育过程中ZFY基因在胚胎中的表达。随着这一假设被Palmer MS等否定及人和小鼠中睾丸决定因子SRY的发现,对ZFY的研究逐渐退却,仅有部分研究将ZFY和ZFX基因用于性别鉴定的研究。但最新的研究结果表明在精子发生过程中也有ZFY基因的表达,并且已经证实在进入减数分裂时ZFY基因的表达量会增加,而且其另一个重要的作用就是确保第二次减数分裂的发生,使雄性个体产生正常的单倍体精子,其等位基因ZFX具有协助作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是普遍存在于动植物体内、高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)介导的诱发同源nRNA特异性降解的基因沉默现象。经过近二十年的不断发展,RNAi以其特异性、高效性及稳定性已经成为功能基因研究领域的主要研究工具。为探究ZFY基因在猪性别控制中的作用,本研究以猪ZFY基因为研究对象,运用RNAi的方法,构建猪ZFY基因干扰载体,并通过体外细胞水平进行干扰载体的筛选,然后进行动物体内试验,以期待获得更多的雌性后代,然后根据体外和体内实验结果分析,探讨ZFY基因在猪性别控制中的相关作用。具体研究及结果如下：1、猪ZFY基因shRNA干扰序列的设计及重组表达载体的构建：根据Ensemble中猪ZFY基因序列信息(登录号ENSSSCT00000013323)及siRNA设计原则,设计并合成9对shRNA序列,然后与慢病毒骨架载体pLentiLox3.7 (pLL3.7)进行重组,构建了9个针对猪ZFY基因的重组表达载体shRNA-1～shRNA-9,测序结果显示,9对shRNA序列均正确插入pLL3.7中,说明重组表达载体构建成功。2、猪ZFY基因shRNA重组表达载体干扰效率的检测(细胞水平)：将构建好的shRNA重组表达载体干扰体外培养的猪生精细胞,qRT-PCR检测生精细胞中ZFY基因的表达,shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3对ZFY基因的表达没有抑制效果,shRNA-4～shRNA-9对ZFY基因的抑制效率分别为：30%、33%、33%、44%、66%和89%,与对照组相比差异均显著(P<0.05)。3、猪ZFY基因shRNA重组表达载体的体内RNAi试验选择对ZFY基因抑制效率较高、特异性较强的shRNA-5重组表达载体和shRNA-9重组表达载体进行猪ZFY基因的体内RNAi试验。选取4头长白公猪,分为A、B两组,每组2头公猪,A组公猪注射重组质粒shRNA-5,B组公猪注射重组质粒shRNA-9,每头公猪注射剂量为3mg(每侧睾丸1.5mg),每10天注射1次,共注射3次,第3次注射后3天开始配种,对照组公猪不进行注射。结果显示：截止到最后一针注射后30天,对照组共配16头母猪,共产仔猪146头,其中母猪比例为56.16%；A组公猪共配16头母猪,共产仔猪152头,雌性比例为34.87%,与对照组相比差异极显著(P<0.01),B组公猪共配16头母猪,共产仔猪144头,其中母猪比例为47.22%,与对照组相比差异不显著(P>0.05)。A组和B组均出现与预期相反的性别偏移,虽然未能获得预期性别的仔猪,但这也充分说明了ZFY基因在动物性别决定过程中的作用,其相关作用机理及本实验中性别反向偏移的原因还需进-步深入研究。另外,A、B两组的平均窝产仔猪数与对照组相比,差异不显著,说明采用RNAi的方法对多胎动物进行性别控制,对动物的受胎率、繁殖率等都没有不利影响。