研究背景和目的临床上,对于先天畸形、外伤、肿瘤切除造成的大体积软组织缺损进行修复一直以来都是整形外科医生面临的重大挑战,这些缺损通常需要复杂的修复重建手术来治疗。吻合血管的自体组织移植是目前最被广泛接受和推荐的治疗。然而,这种手术有很多技术上的挑战,而且还不可避免地导致供区的缺损畸形。目前一个以解决软组织缺损修复重建的新领域一脂肪组织工程技术,为自体组织瓣移植提供了另一种可能的选择。2007年,研究人员将一个带腹壁浅血管蒂的脂肪瓣插入一个中空的小室中,再植入大鼠的腹股沟皮下,最终导致了腹股沟脂肪瓣的显著增长。这种组织工程室(TEC)技术为组织工程领域提供了新的可能。先前的研究已经表明,TEC技术可以产生大量的脂肪组织。然而,在大动物体内长期的观察表明,植入的脂肪瓣最终不能100%完全填满工程室内的所有空间,这就意味着工程化脂肪瓣的体积没有最大化。我们之前关于大鼠的研究可能可以解释这个现象,我们发现当把TEC小室植入动物体内,新生的组织表面覆盖了一层厚厚的包膜囊。这个包膜囊可能降低了来自脂肪瓣周围的灌注从面限制了脂肪瓣的进一步增长。因此,我们推测包膜囊的形成可能是限制工程化组织瓣达到其最大体积的关键因素之一。另一方面,虽然该包膜囊可以限制脂肪瓣的体积增长,但是它也可以维持TEC所构建脂肪瓣的外形。据先前的报道所知,Morrison团队所构建出的组织瓣大都是单一的半球形。然而面对临床上的形形色色的缺损,我们不禁提出疑问：利用组织工程室技术能否构建出不同形状的脂肪瓣?如何构建接近临床需求的更大体积的脂肪瓣?这些构建出的工程化脂肪瓣的原位远期转归又如何呢?基于以上的观察,我们推测使用TEC可以实现脂肪瓣的形状预构。首先将脂肪瓣放入合适形状的组织工程小室中,当脂肪瓣体积稳定后去除小室,可以促进成形的脂肪瓣的进一步生长。为了检测这个“两步法”技术,我们进行了以下实验：运用兔模型将带蒂脂肪组织瓣置于不同形状的小室中,并观察在此过程中大体和组织学的变化。方法1、组织工程室内大体积带蒂脂肪组织瓣的形状预构在兔背部皮下放置圆形与心形两种形状组织工程室,再将带蒂脂肪瓣放入小室内。在不同时间点(2周、4周、8周)观察构建物的体积、形状、组织学等动态变化的过程。2、构建物二次增长模式的研究在利用组织工程室模型构建稳定的组织瓣后,将小室去除后,4周后再原位观察构建物的变化情况,通过体积测量、组织学的变化来探讨二次增长模式的可行性。3、组织工程室诱导的构建物的原位长期转归的观察利用组织工程室技术构建成熟的脂肪组织瓣后,一侧小室去除另一侧小室保留,并分别观察在小室内的以及去除小室后的构建物在不同时间点(16周、24周)的变化。4、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS 13.0进行数据处理。两组之间同一时间点比较采用Bonferroni’s检验；同组不同时间点的差异采用协方差分析及post-hoc分析的T检验。结果1、不同形状的组织工程室内构建物在2周时外形与小室吻合,但构建物外周以胶样物质填充,脂肪瓣内部组织学出现血管形成伴随着脂肪新生,伴炎性细胞浸润,外周以炎性细胞浸润为主；4周时构建物形状与小室基本吻合,血管化及脂肪化趋于稳定,4周一8周时外形无明显变化但组织学表现为具有标志性脂肪小叶结构的成熟脂肪组织,表面被一以纤维结缔组织成分为主的包膜包裹。2、将小室去除后4周组织瓣体积再一次明显的抬升,实现了二次增长。组织学观察发现与室内第一次诱导新生相似,脂肪瓣内部再次出现血管形成并伴随着脂肪新生,可见炎性细胞浸润,包膜厚度较室内组织瓣变薄。全组织染色检测发现Lectin及Ki67阳性细胞均有增加进一步提示脂肪瓣内部再次出现血管化及细胞增殖。3、去除小室后两种不同形状小室构建物体积在16周时均有轻度增加,到24周达到稳定,24周体积与16周相比无统计学差异。两种不同形状的组织瓣形状仍能维持。一直在小室内的构建物体积在4周时达到相对稳定,一直持续至24周。讨论临床上修复大体积软组织缺损常用的方法是皮瓣转移或脂肪移植来进行修复。皮瓣转移手术塑形困难,供皮的继发损伤较大,自体游离脂肪移植后吸收率高,且远期效果欠佳。2003年提出了“组织工程室”的概念,生物体内的工程化带血管蒂脂肪瓣解决了大体积软组织缺损修复重建的难题。对于修复临床上的缺损,我们很难找到一个带血管的与缺损形状吻合的复杂的组织结构去重建修复。虽然一块带血管蒂的脂肪瓣置入组织工程小室中能构建血管化良好的成熟脂肪组织,但是,之前的研究都不能使小室内的脂肪瓣体积增大到能够完全充满植入小室的容积。在本实验中,我们展示的是一种在兔模型中不添加任何外源性的血管化或脂肪化的生长因子以及生物可降解的细胞外基质支架,而成功构建出与组织工程室形状吻合的大体积血管化脂肪瓣。众所周知,脂肪化分为两个阶段：间充质干细胞先分化成脂肪前体细胞,再从脂肪前体细胞最终分化成成熟脂肪细胞。在脂肪组织工程中,在细胞自身分泌ECM之前,需要合适的ECM来为细胞提供支撑,让细胞粘附于ECM上进行增殖和分化。所以,添加生长因子如成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子被广泛应用于脂肪组织工程中来促进脂肪化。但在我们的动物实验研究中,没有添加任何的外源性的ECM或者生长因子,同样构建出了大体积脂肪瓣。Findlay等报道了利用脂肪组织工程模型,不添加ECM和生长因子的情况下,在猪体内构建出了大体积的脂肪组织,也说明了在这个过程中ECM和生长因子不是必需的。目前,添加ECM及生长因子是否可以得到一个更好的构建物仍需要进一步的研究。我们通过实验可以在2周时看到明显脂肪化的证据,在8周时脂肪组织已逐渐成熟。在受到任何的创伤刺激时,各种各样的细胞内及细胞间的信号通路会激活,它们共同作用去修复组织的完整性来维持生物体内平衡。这个组织修复愈合的复杂过程基本存在于所有的组织内当然也包括脂肪组织。之前也有研究证明,由外科操作引起的创伤及炎症是促进组织工程室内脂肪瓣成血管化及成脂化的关键因素之一。另外,脂肪瓣中细胞与细胞间的接触丧失及脂肪瓣所受到的机械力可以通过力传导的方式来促进小室内组织的有丝分裂。综上所述,以上的这些因素使得组织工程室内的脂肪瓣在前8周迅速增长。但是,随着实验的进行,我们发现在实验对照组中,虽然圆形小室内构建物体积从0.8ml增长到了5.09ml,心形小室内的体积也从0.8ml增至了3.65ml,但之后从8周到24周,体积上和组织学上都没有了明显的变化。很多证据表明当生物体内植入异物时,会引起特异的愈合反应,这种愈合是有多种细胞信号参与的复杂炎症反应,通过把成纤维细胞迁移到植入物表面,接着成纤维细胞分化成表达SMA的肌成纤维细胞。这些肌成纤维细胞分泌胶原包膜来将异物与周围的软组织分开。这层厚包膜使得细胞获得细胞与细胞间的接触抑制从而限制脂肪瓣的生长,从而创伤愈合才趋于稳定。所以,当脂肪化与纤维化在8周达到平台期时,脂肪瓣的体积才保持相对稳定一直到24周。令我们惊讶的是,当我们在8周时去除小室后,12周时发现脂肪瓣表面包膜变薄,脂肪瓣体积进一步增加。圆形小室体积从5.09ml增至10.98ml,心形小室从3.65ml增至7.15ml。脂肪组织的再次生长可能是由于小室去除操作引起的创伤或炎症环境的上调以及导致包膜的异物反应的下调。但同时,在12周到24周过程中,一旦皮下的空隙被新生组织填满生长就会停止。然而,虽然包膜会限制脂肪瓣的生长,同时它在小室去除后的16周中,也有助于维持组织工程室构建出来的脂肪瓣的形状,提示特定形状的脂肪瓣可以通过这种方法来构建从而满足临床需要。更长时间的观察还需进一步的实验。令我们好奇的是,我们还发现在空白对照组中,当0周和8周进行两次假手术后,脂肪瓣中也发现许多血管化良好的间质组织,但是最终没有明显的组织生长。很多研究已经报道机械力的改变可以促进成血管化和生长因子的上调。Harunosuke Kato等也发现组织的外在悬浮可以通过激活现在的祖细胞来诱导脂肪组织的增大。因此,空白对照组脂肪瓣不增长可能是由于炎症反应后缺少机械力的作用,而短时间的创伤或炎症环境还不足以诱导脂肪瓣的增长。Findlay等利用脂肪组织工程模型在猪的体内诱导出大体积的组织瓣,在他们的实验中,从工程化组织瓣上去除小室后,相对于动物的增长速率而言反而减缓了脂肪瓣的生长,而在我们的兔模型实验中,去除小室后组织却再次快速生长。这种不同的实验结果可能是由于两种不同的实验动物导致的。猪不像兔子一样体重比较恒定,猪的体重会增长,所以可能会在此实验中产生混杂的影响。其次,我们的组织工程室植入的兔背部皮下,兔的皮肤质地比猪的腹股沟皮肤要疏松很多。所以,当去除小室后,被小室扩张的皮肤及周围组织只对构建物产生比较轻的压力,使得脂肪瓣能进一步增长。这就意味着当皮下有充足的空间以及小室去除后的小压力很可能让脂肪瓣继续增长,然而,本研究结果还是应该在其它动物模型中进一步证实。这是继澳大利亚实验团队构建出大体积软组织瓣后首次探讨定形状脂肪组织瓣的研究,同时提出了组织工程室技术二次增长模式的概念,也做了较长时间的稳定性观察,对于将来组织工程室技术诱导大体积软组织再生应用于临床提供了实验基础。尽管组织工程室技术的构建方案尚不完全成熟,构建物形状尚不能精确的预构,但其组织学为以成熟脂肪结构为主的软组织瓣,远期稳定性值得肯定,因此这种大体积工程化脂肪组织构建策略对于临床上各种部位、不同形状的大体积软组织缺损的修复,可以在体内由小到大预构出定形状的带血管蒂的脂肪瓣,像皮肤扩张器一样先扩张后移植,避免传统的切除脂肪瓣后造成的继发供区畸形,不失为一种安全、稳定、有效的新途径。结论1、运用组织工程室技术可以实现不同形状大体积带蒂脂肪瓣的预构。2、通过去除工程室原位可诱导脂肪瓣的体积二次增长,实现更大体积脂肪瓣的构建。3、利用组织工程室技术构建的脂肪瓣在去除小室后原位可保持其形状及体积的稳定性。