前言　　 喉癌是上呼吸道常见的恶性肿瘤之一,其发病率有逐年上升的趋势,越来越多的资料支持肿瘤抑制基因失活在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。在前期工作中,我们发现在染色体6q25区域可能存在喉癌新的相关基因,应用电子杂交方法在此区域克隆了一个新基因,并获得其全长DNA序列,将其命名为MTLC(c-Myc target from laryngeal cancer cells)。我们充分利用东北地区的病源优势,进一步研究发现MTLG基因在喉癌中表达降低,转染MTLC的肿瘤细胞凋亡水平增加,细胞增殖能力下降,而干涉MTLC后的肿瘤细胞凋亡水平下降,细胞增殖能力增加。利用我们自行设计的cDNA芯片对喉正常组织(癌旁组织)、癌组织和癌转移组织中MTLC基因的转录水平进行分析,结果显示癌旁组织、癌组织和转移淋巴结组织中MTLCmRNA水平依次递减,表明MTCG基因参与喉癌的发生、发展,提示MTLC具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的能力,可能是一新的候选肿瘤抑制基因。肿瘤抑癌基因的失活可能是由于基因发生了诸如突变、杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)、表观遗传学如DNA甲基化等变化所引起的,而这三种变化通常并非同时出现在同一肿瘤中。肿瘤二次突变学说认为,一个等位基因的缺失,而另一个等位基因的突变通常导致肿瘤抑制基因失活。作为遗传及表观遗传性疾病,肿瘤的发生与异常甲基化密切相关。DNA甲基化通过直接抑制DNA结合蛋白与相应序列的结合而抑制基因表达。存在于DNA结合蛋白相应识别序列尤其是转录因子相应识别序列的胞嘧啶甲基化可以抑制DNA结合蛋白尤其是转录因子与相应识别序列的结合,从而直接影响该基因编码蛋白的表达。迄今为止,有关MTLC基因在喉癌中失活机制的具体研究未见报道。本研究中,我们通过生物信息学资源结合变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)、亚硫酸氢盐PCR(bisulfite-PCR,BSP)结合测序及限制性内切酶酶切分析法(restriction enzyme digestion analysis)分别筛查喉癌组织标本的突变、LOH和甲基化的发生情况,分析探讨MTLG基因在喉癌中失活的机制。根据甲基化研究结果,我们进一步通过凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、突变型启动子报道基因载体构建,深入探讨甲基化对转录因子c-Myc结合及MTLC基因启动子转录活性的影响,阐述MTLC基因表达的调控机制,以发现可能的喉癌诊断和治疗的分子标志物,为寻找具有应用价值的喉癌特异性分子靶标奠定基础。　　 材料与方法　　 利用数据库、生物信息学软件,查找MTLC基因编码序列、基因连锁的STR位点、预测启动子区域CpG岛,采用变性梯度凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、亚硫酸氢盐PCR(bisulfite-PCR,BSP)结合测序及限制性内切酶酶切法,筛查喉癌组织标本突变、LOH和甲基化发生情况,分析MTLC基因在喉癌中失活机制。通过凝胶迁移阻滞实验,探讨甲基化对转录因子c-Myc结合的影响,构建突变型启动子报道基因载体,通过双荧光素酶报告基因系统检测甲基化对MTLC基因启动子转录活性的影响。　　 实验结果　　 一、喉癌组织中MTLC基因突变检测分析　　 对73例喉癌组织MTLC基因第一、二外显子编码序列进行突变筛查,未发现突变。　　 二、喉癌组织中MTLC基因杂合性缺失检测分析　　 对73例喉癌组织MTLC基因进行杂合性缺失检测,结果显示位点D6S440和D6S2420表现杂合性但无LOH,位点D6S290在喉癌组织中杂合度低,不具有统计意义;位点D6S441、D6S2442和D6S1577的LOH频率分别为42.5%、36.1%和21.9%;位点D6S2436在46.6%的喉组织中表现为微卫星不稳定。　　 三、喉癌组织中MTLC基因甲基化检测分析　　 MTLC基因启动子区域存在CpG岛;10例MTLC基因5侧翼序列在喉癌组织中呈高甲基化状态,而在癌旁对照组织多为低甲基化。在CpG岛内cgcg位点为转录因子c-MycDNA识别序列,AccⅡ酶切鉴定发现甲基化频率高达65%。　　 四、甲基化对转录因子c-Myc结合的影响　　 EMSA研究结果表明CGCG位点甲基化减弱转录因子c-Myc与MTLC基因启动子的结合。　　 五、甲基化对MTLC基因启动子转录活性的影响　　 根据甲基化研究结果构建突变型启动子报道基因载体,双荧光素酶报告基因系统检测结果发现甲基化影响MTLC基因启动子转录活性,使MTLC基因启动子转录活性消失。去甲基化处理后,MTLC基因启动子转录活性显著增强(P＜0.05)。　　 结论　　 (1)点突变不是MTLC基因在喉癌中失活的原因。　　 (2)候选肿瘤抑制基因MTLC在喉鳞癌组织中表达下调的机制是杂合性缺失和启动子区域高甲基化。其中转录因子c-Myc结合的DNA识别序列中cgcg位点甲基化状态与喉癌的发生发展存在相关性。　　 (3)在MTLC基因上游-555～-546中,C-MYC结合序列位于启动子核心序列中,甲基化通过影响C-MYC与MTLC启动子的结合能力、抑制MTLC基因启动子的转录活性调控MYLC的表达。