【摘 要】
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目的:肺炎克雷伯菌感染已成为院内感染患者死亡的独立高危险因素,它的治疗及预防给临床带来了极大的困难。本研究收集盐城第一人民医院2018年9月至2019年10月104株非重复肺炎克雷伯菌株,分析其主要的耐药机制、耐药表型、分子分型及临床治疗用药的现状,探查104株菌株的同源性及可能的传播路径,为临床用药和院内感染的防控提供依据。方法:1.菌株的收集与保存:收集盐城第一人民医院2018年9月至2019
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目的:肺炎克雷伯菌感染已成为院内感染患者死亡的独立高危险因素,它的治疗及预防给临床带来了极大的困难。本研究收集盐城第一人民医院2018年9月至2019年10月104株非重复肺炎克雷伯菌株,分析其主要的耐药机制、耐药表型、分子分型及临床治疗用药的现状,探查104株菌株的同源性及可能的传播路径,为临床用药和院内感染的防控提供依据。方法:1.菌株的收集与保存:收集盐城第一人民医院2018年9月至2019年10月间肺炎克雷伯菌株,经血平板培养分离纯化后,挑取部分菌落,装进磁珠冻存管里,管上编号从f6648-f6753,最后-80℃条件下冻存。2.菌株鉴定和药敏试验:使用全自动微生物鉴定系统VITEK2COMPACT进行细菌鉴定并测定相关抗生素最小抑菌浓度;使用改良碳青霉烯类水解实验判断菌株的产碳青霉烯酶表型。3.耐药基因检测:采用煮沸法分别提取各菌株的DNA,通过PCR扩增的方法对产碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）以及多粘菌素耐药基因blamcr-1进行分子检测,并对阳性结果通过Sanger测序进一步鉴定。4.分子特征研究:通过多重PCR扩增技术对肺炎克雷伯菌的ST分型（ST11、ST258、ST23、ST65、ST375、ST86）,荚膜血清型（wzyK1、wzyK2、wzyK64、wzyK47）和毒力相关基因（rmpA、rmpA2、iroN、iutA）进行检测。通过脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）对肺炎克雷伯菌进行性同源性分析,以此归纳流行病学特征。5.全基因组测序（Wholegenomesequencing,WGS）:根据菌株所携带的耐药基因及分子特征研究结果,筛选10株菌株进行全基因组测序。根据测序结果,菌株携带的耐药基因和毒力基因都存在差异,单个核苷酸也存在多态性,由此可以分析在院内的可能传播路径。结果:1.所收集的104株肺炎克雷伯菌经Vitek2compact系统鉴定,49株对亚胺培南耐药,其余55株则为亚胺培南敏感菌株。2.根据药物敏感性试验,对亚胺培南耐药的49株菌株对头孢曲松、头孢吡肟、氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦等抗生素的耐药率均为1 00%;对喹诺酮类药物中的环丙沙星和左氧氟沙星耐药率达到100%;对氨基糖苷类药物中的阿米卡星的耐药率达到了 44.9%左右。对亚胺培南敏感的55株菌株对氨苄西林的耐药率为100%;对喹诺酮类药物中的环丙沙星耐药率达50.9%,左氧氟沙星为34.5%;但对氨基糖苷类药物中的阿米卡星的耐药率仅为1.8%。3.碳青霉烯类水解试验显示对亚胺培南耐药的49株肺炎克雷伯中46株能通过合成碳青霉烯酶获得抗性。4.通过PCR扩增及序列测定,耐药菌株有46株携带blaKPC-2、2株携带blaOXA-232,未检出blaNDM、blaVIM、blaIMP及blamcr-1基因;敏感菌株有1株携带blaOXA-232,未检出 blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP及 blamcr-1 基因。5.样本菌株ST分型显示,耐药菌株中20株为ST15,18株为ST11,11株为其他型;敏感菌株以其他型为主。PFGE结果显示104株样本可分为15个克隆型,其中有63株属于同一克隆株,菌株相似度超过80%。6.结合多重PCR及PFGE分型结果,选取3株携带blaKPC-2,3株携带blaOXA232,4株耐药基因全部阴性进行全基因组测序。所有菌株的功能基因数量相近,突变位点数相近,近一半分布于外显子区域;但单个核苷酸多态性的差异,使各菌株所携带的耐药基因和毒力基因等有所不同。结论:1.该院肺炎克雷伯菌耐药株,对碳青霉烯类抗生素产生耐药主要是因为该菌合成KPC酶;肺炎克雷伯菌对常用抗生素的耐药性有逐步上升的趋势,这就要求临床用药需要参考药敏试验结果,不断更新合理化、个体化,甚至联合用药等治疗方案。2.肺炎克雷伯菌耐药株主要为ST15型和ST11型,PFGE呈高度同源性,结合10株菌株全基因组测序结果,提示该院肺炎克雷伯菌的单个克隆菌株不但引起院内广泛传播,而且还可能存在长期定植,在经过较长一段时间后会突变形成不同菌株,故需进一步加强对肺炎克雷伯菌耐药菌株的连续监测,不断提高院内感染防控水平。
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