糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种常见的内分泌代谢性疾病,随着社会经济生活的提高,全球范围内糖尿病,特别是Ⅱ型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)患者急剧增长。糖尿病正在成为危害大众健康的主要公共卫生问题。糖尿病可导致多种并发症,糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的主要并发症之一,临床上,超过40%的终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)由糖尿病引起。为此,研究糖尿病致肾脏损伤机制成为基础医学研究的重要课题。尽管目前有很多治疗糖尿病药物,但长期的临床观察发现,这些药物对并发症的发生、靶器官的损伤并没有确切的保护作用,甚至部分药物有明显的副作用。例如,双胍类药物容易引起消化道症状,特别是在老年患者中容易引起乳酸中毒；磺脲类药物和胰岛素容易引起低血糖和肥胖。Ⅱ型糖尿病是进行性疾病,随着疾病的发展,胰腺分泌胰岛素能力因衰竭而不断下降,病情加重,血糖失去控制,现行药物只能通过增大剂量或者添加其他降糖药物联合治疗,这就增加了治疗方案的复杂度和风险,为此,研发新的治疗糖尿病药物成为迫切需求。肾脏在葡萄糖稳态(glucose homeostasis)中发挥重要作用。健康成年人肾小球每天滤过将近180g葡萄糖,其中大部分被肾脏重吸收,剩下不足0.5g通过尿液排出体外。家族性肾性糖尿(familial renal glycosuria,FRG)有尿糖增多的临床表现,但这种病人的血糖浓度和肾功能无明显异常。经研究发现是这类病人肾脏SLCA2基因发生突变,SGLT2功能受到损害。SGLT2(sodium-glucose cotransporter2)是高容量、低亲和力的跨膜转运蛋白质,分布在肾脏近端小管细胞腔面膜,小管液中葡萄糖通过SGLT2进入细胞后,又能被位于小管上皮细胞基底膜上的GLUT (Glucose transporter)转运至胞外,经间质进入小管周围毛细血管网中,从而完成肾小管对葡萄糖的重吸收。SGLT2主要分布于近端小管的前段,与基底膜侧的GLUT2配合,重吸收葡萄糖,正常生理状态下,约90%滤过的葡萄糖经SGLT2重吸收,剩余10%由位于远端小管的SGLT1重吸收。SGLT2特异性分布在肾脏,抑制SGLT2对其它组织器官糖的转运和利用无显著影响。自然界存在天然的SGLT2抑制剂根皮苷(phlorizin),它最初是在苹果树皮的提取物中发现的。由于根皮苷口服几乎不吸收、选择性差等原因,没有被开发成抗糖尿病药物,但以它为前体化合物,开发了许多新结构的SGLT2印制剂,部分药物已经进入临床研究阶段。SGLT2抑制剂通过增加尿糖排泄从而降低血糖,是一种新型降糖药物,因其作用机制为非胰岛素依赖,理论上可作为其他抗糖尿病药物的补充、辅助药物,用于各类型、各个阶段的糖尿病治疗。糖尿病病人机体血糖异常升高,使体内细胞长期处于高糖环境中,引起氧化应激、非酶糖基化、多种炎症和细胞因子过度激活,进而导致靶器官损伤。那么,抑制SGLT2后,通过增加尿糖排出,降低血糖对糖尿病、糖尿病引起的肾损伤有什么影响,什么因素参与SGLT2抑制剂对肾脏的影响等成为本课题研究的问题。为此,本实验在STZ诱导的糖尿病大鼠和db/db小鼠动物模型中,观察抑制SGLT2对糖尿病肾损害的作用,并进一步探讨其发生机制。课题研究由以下两部分组成：一、抑制SGLT2对STZ诱导的糖尿病大鼠肾损伤的作用及机制1、正常SD大鼠腹腔注射STZ造成糖尿病模型成功后,大鼠继续喂养2周后开始给药,给药时间为期六周。实验分成五组：正常组(Con)、Dapa处理组(Con+Dapa)、模型组(DM)、Dapa处理组(DM+Dapa)及阳性对照组(DM+Cande)。各组分别观察大鼠血糖、尿糖、尿量、肾重/体重比变化。DM组血糖、尿糖、尿量、肾重／体重比明显升高,DM+Dapa组大鼠血糖显著降低,尿糖、尿量进一步升高,肾重／体重比降低。DM+Cande组大鼠血糖、尿糖、尿量没有明显改变,肾重／体重比降低。DM组、DM+Dapa组、DM+Cande组大鼠之间体重没有差异,Con组和Con+Dapa组大鼠之间体重没有差异。这证实抑制SGLT2可以通过增加尿糖排泄降低血糖。2、通过Western blot观察到,DM组大鼠SGLT2蛋白表达水平相比Con组升高,Con+Dapa组和DM+Dapa组SGLT2蛋白表达水平相比Con组显著升高。DM+Cande组大鼠SGLT2蛋白表达水平相比Con组升高,相比DM组没有变化。3、DM组大鼠24小时尿蛋白、血浆尿素氮、肌酐相比Con组明显升高,DM+Dapa组和DM+Cande组大鼠24小时尿蛋白、血浆尿素氮、肌酐相比DM组显著降低。光镜下,PAS染色DM组基底膜有所增厚,DM组肾小球体积有所增大,系膜细胞有所增生,但变化不显著；HE染色各组均未见明显的结构差别和炎症细胞浸润；Masson染色各组均未见明显的胶原沉积。电镜下观察到DM组肾小球基底膜有局部增厚,部分上皮足突有融合,其余结构未见病变,肾小管结构基本正常。通过Western blot;观察肾脏胶原蛋白Collagen I蛋白表达水平,DM组Collagen I蛋白表达水平显著升高,DM+Dapa组和DM+Cande组大鼠相比DM组Collagen I水平的升高明显减少。这些结果提示抑制SGLT2可以延缓糖尿病肾损伤。4、DM组大鼠糖基化终产物(advanced glycation end products, AGE)、丙二醛(MDA)、TGF-β水平显著上升,DM+Dapa组和DM+Cande组能够减少AGEs、MDA、TGF-β的升高,提示AGEs、MDA、TGF-β可能参与抑制SGLT2对肾损伤的保护作用。二、抑制SGLT2对db/db糖尿病小鼠肾损伤的作用及机制1、C57BL/6小鼠和db/db小鼠适应环境一周后开始给药,给药时间为期六周。实验分成五组：正常组(Con)、Dapa处理组(Con+Dapa)、模型组(DM)、Dapa处理组(DM+Dapa)及阳性对照组(DM+Cande)。各组分别观察小鼠血糖、体重的变化。DM组小鼠相比Con组小鼠血糖明显升高,体型肥胖,体重增加,DM+Dapa组小鼠相比DM组血糖明显降低,体重减轻；DM+Cande组小鼠相比DM组血糖、体重没有明显变化。Con+Dapa组小鼠相比Con组血糖没有明显变化,体重减轻。这证明SGLT2抑制剂能够降低血糖和Ⅱ型糖尿病的体重增加。2、通过Western blot观察到DM组小鼠SGLT2蛋白表达水平相比Con组升高,Con+Dapa组和DM+Dapa组SGLT2蛋白表达水平相比Con组显著升高。DM+Cande组大鼠SGLT2蛋白表达水平相比Con组升高,相比DM组没有变化。3、小鼠各组间尿素氮、肌酐水平均未见显著差异,这是由于db/db小鼠糖尿病一般在糖尿病发生10周后相关指标才开始发生改变。DM组PAS染色基底膜有所增厚,但变化不显著。通过Western blot观察肾脏胶原蛋白Collagen I蛋白表达水平,DM组Collagen I蛋白表达水平相比Con组显著升高,DM+Dapa组和DM+Cande组相比DM组Collagen I水平的升高明显减少。这提示抑制SGLT2可以延缓糖尿病肾损伤。4、DM组糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)、丙二醛(MDA)、TGF-β水平相比Con组显著升高,DM+Dapa组和DM+Cande组能够减少AGEs、MDA、TGF-β的升高,提示AGEs、MDA、TGF-β参与抑制SGLT2对肾损伤的保护作用。综上所述,本实验从STZ诱导大鼠形成的一型糖尿病模型和db/db二型糖尿病小鼠模型上都观察到抑制SGLT2能够增加尿糖排泄,降低血糖,同时保护肾脏损伤,具体可能的机制与机体血糖水平降低后,抑制肾脏AGEs、MDA、TGF-β生成增加有关。