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研究目的:一般人群中神经病理性疼痛的患病率约为7%~10%,目前还没有确切的病因治疗方法。越来越多的证据表明,运动可能在周围性神经病理性疼痛治疗中发挥积极作用,但其作用机制仍不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)是内源性非编码微小RNA,长度约23个核苷酸,研究发现miRNA可能通过调控疼痛相关靶基因从而实现在神经病理性疼痛中的作用。背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)是痛觉传入通路中的第一级神经元,其功能异常能导致神经病理性疼痛的发生。目前关于神经病理性疼痛运动干预后DRG适应机制的研究非常有限,尚未有研究采用转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术系统地探索周围性神经病理性疼痛运动干预后DRG组织出现的miRNA、mRNA变化及涉及的生物学功能变化。基于此,本研究目的:1.探索运动改善周围性神经病理性疼痛的循证医学证据。2.坐骨神经慢性压迫(Chronic constriction injury,CCI)诱导的神经病理性疼痛大鼠运动干预后DRG组织转录组学中miRNA、mRNA变化,差异性表达基因相关生物学功能及信号转导途径。3.寻找参与运动改善CCI诱导的神经病理性疼痛的关键miRNA及其靶基因。4.探索特定miRNA/mRNA信号途径在运动缓解周围性神经病理性疼痛中的作用和机制。研究方法:本论文包括四个研究,研究一中,计算机检索PubMed、EMBASE和Web of Science数据库。纳入运动与不运动或安慰性运动相比较的周围性神经病理性疼痛动物实验研究。选取疼痛行为学测试作为结局指标,连续性数据采用均数差(Mean differences,MDs)和95%置信区间(Confidence intervals,CIs)表示,使用RevMan5.3软件进行Meta分析。研究二中,选用成年Sprague Dawley大鼠,建立CCI模型,将大鼠随机分为假手术组(n=6)、CCI组(n=6)和运动组(n=6)。运动组进行4周游泳训练,其余两组常规饲养。术前及术后3天、7天、14天、21天和28天进行机械性刺激缩足阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足反射潜伏期(Thermal withdrawal latency,TWL)测试评估坐骨神经损伤后痛觉过敏情况。4周后取结扎侧坐骨神经作HE染色以进一步确认模型构建是否成功;取结扎同侧L4-L6 DRG进行RNA-seq,经标准化分析确定差异性表达基因,然后对差异性表达基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。最后通过定量即时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对关键性差异性表达基因进行定量分析。研究三中,首先通过计算机生物信息学软件RNAhybrid预测关键性基因miR-145-5p与Cacna2d1的结合序列。然后进行细胞实验,双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系,设计合成Cacna2d1 3’-UTR序列和突变后Cacna2d1 3’-UTR序列,将两种目的基因片段克隆到psiCHECK-2双荧光素酶报告基因载体,构建Cacna2d1野生型(psiCHECK-Cacna2d1)和突变型(psiCHECK-Cacna2d1-mut)重组载体质粒。将这两种重组载体质粒与miR-145-5p模拟物(mimics)或miR-145-5p阴性对照(Negative control,NC)共转染至人肾上皮(293T)细胞中,最后利用双荧光素酶检测系统检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。研究四中,将成年Sprague Dawley大鼠随机分为正常组(n=15)、假手术组(n=15)、假手术+运动组(n=15)、CCI组(n=15)和CCI组+运动组(n=15)。运动组进行4周游泳训练,其余组常规饲养。术前及术后进行MWT和TWL测试。HE染色观察结扎侧坐骨神经及DRG形态变化;免疫荧光双染评价Cacna2d1的表达变化及位置;qRT-PCR和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测DRG组织中miR-145-5p和Cacna2d1 mRNA和蛋白表达水平情况。研究结果:研究一中,共纳入14项研究。Meta分析显示,运动可以显著增加造模后1周[MD=0.91,95%CI(0.11,1.71),P=0.03]、2周[MD=3.11,95%CI(1.56,4.66),P<0.001]、3周[MD=3.48,95%CI(2.70,4.26),P<0.001]、4周[MD=4.16,95%CI(2.53,5.79),P<0.001]和5周[MD=5.58,95%CI(3.44,7.7 3),P<0.001]时的MWT;同时显著增加造模后1周[MD=2.48,95%CI(0.59,4.38),P=0.01],2周[MD=3.57,95%CI(2.10,5.05),P<0.001],3周[MD=3.92,95%CI(2.82,5.03),P<0.001]和4周[MD=2.84,95%CI(1.29,4.39),P<0.001]时的TWL。研究二中,CCI组和运动组造模侧MWT在术后第3天、第7天和第14天时均显著低于假手术组(P<0.01),术后第21天和第28天时,运动组造模侧MWT较CCI组明显升高(P<0.01);CCI组和运动组造模侧TWL在术后第3天、第7天和第14天均显著低于假手术组(P<0.01),术后第14天、第21天和第28天时,运动组造模侧TWL水平较CCI组明显升高(P<0.01)。HE染色显示CCI组坐骨神经神经纤维散乱,髓鞘空泡化,施万细胞增殖,外周炎症细胞浸润,提示造模成功。在两个比较组合中(假手术组与CCI组、CCI组与运动组)共发现4个共同差异性表达miRNAs(P<0.05)和186个共同差异性表达mRNAs(P<0.05)。通过检索大鼠基因数据库及比对疾病注释,发现与神经病理性疼痛相关的mRNAs共14个。最后miR-145-5p、miR-341、miR-300-5p、miR-653-5p、Atf3、Cacna2d1、Gal和Ctss经qRT-PCR验证(P<0.01或P<0.05)。假手术组与CCI组比较,主要在炎症、瞬时受体电位通道、TNF信号通路、Rap1信号通路、NF-κB信号通路和MAPK信号通路富集(P<0.05);运动4周后,主要在HIF-1信号通路、Rap1信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路和神经营养蛋白信号通路富集(P<0.05)。研究三中,RNAhybrid2.2软件预测Cacna2d1 3’-UTR的第3809–3836碱基位置与miR-145-5p存在完全或不完全互补配对的结合位点。双荧光素酶检测结果显示,与miR-145-5p NC和psiCHECK-Cacna2d1组相比,共转染miR-145-5p和psiCHECK-Cacna2d1实验组相对荧光显著减少(P<0.05)。与miR-145-5p NC和psiCHECK-Cacna2d1-mut组相比,共转染miR-145-5p和psiCHECK-Cacna2d1-mut组相对荧光无显著变化(P>0.05)。研究四中,在术后第21天和第28天时,CCI+运动组MWT较CCI组明显升高(P<0.01);在术后第14天、第21天和第28天时,CCI+运动组TWL水平较CCI组明显升高(P<0.01)。HE染色显示CCI组坐骨神经神经纤维散乱,髓鞘空泡化,施万细胞增殖,外周炎症细胞浸润,运动后有明显改善;CCI组DRG神经胶质细胞增多,神经元空泡样变性,尼氏体数量减少,神经纤维形态不完整,运动后有明显改善。免疫荧光双染显示CCI组Cacna2d1表达水平在DRG神经元胞体中显著增加,运动后明显改善(P<0.01)。qRT-PCR和WB检测显示,CCI组miR-145-5p表达水平显著降低(P<0.01),Cacna2d1 mRNA和蛋白表达水平显著提高(P<0.01)。运动4周后,CCI+运动组miR-145-5p表达水平较CCI组比较显著提高(P<0.05),Cacna2d1 mRNA和蛋白表达水平较CCI组比较显著降低(P<0.01)。研究结论:1.Meta分析的结果显示运动能够改善周围性神经病理性疼痛模型大鼠疼痛,提示运动发挥了重要的作用,但结果受到偏移风险的影响等,需进一步验证。2.CCI大鼠DRG组织对运动的适应机制可能与多个差异性表达基因相关,它们是miR-145-5p、miR-341、miR-300-5p、miR-653-5p、Atf3、Cacna2d1、Gal和Ctss。这些差异性表达基因可能成为研究运动干预周围性神经病理性疼痛疗效机制新的靶点。3.细胞实验证实Cacna2d1是miR-145-5p的靶基因,miR-145-5p可以通过与Cacna2d1 3’-UTR的结合在转录后水平抑制Cacna2d1的表达。4.在体实验发现miR-145-5p可能通过靶向抑制Cacna2d1表达参与运动改善CCI大鼠疼觉过敏的疗效机制。