牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex,BRDC）是一种由多个因素引起的传染病,也是危害我国牛养殖业的主要因素。IBRV、BCo V、BRSV、BPIV3是引发BRDC的主要病毒性病原,临床症状极其相似,在临床诊断上是一个挑战,因此病原学诊断方法在鉴别该类病原上显得尤为重要。基于IBRV、BCo V、BRSV、BPIV3的特点,分别选取保守基因IBRV g B基因、BCo V N基因、BRSV F基因、BPIV3 HN基因,设计特异性引物,建立了IBRV、BCo V、BRSV、BPIV3四重PCR检测方法,扩增目的基因片段大小分别为185 bp、597 bp、260 bp、400 bp。本文首先对单一PCR方法进行了初步探索,IBRV、BRSV、BPIV3、BCo V四种病原单一PCR方法的最低检测下限分别为3.72×10-7 ng/μL、3.14×10-6ng/μL、2.86×10-7 ng/μL、2.92×10-5 ng/μL。通过对多重PCR方法的反应体系与反应程序进行优化,多重PCR的退火温度、延伸时间、循环数、引物体积、酶含量分别为60℃、30s、30次、0.6μL、1.6μL。该方法对IBRV、BRSV、BCo V、BPIV3的最低检测限分别为3.72×10-3ng/μL、3.14×10-6ng/μL、2.86×10-4ng/μL、2.92×10-6ng/μL。对临床96份样品进行检测,与经典PCR检测方法相比,阳性符合率为96.3%。进一步对河北某地区分离出的IBRV进行二代全基因测序,经过系统进化树分析该分离株与澳大利亚B589株亲缘关系最近。又通过多款在线分析工具,对HBKS-IBRV分离株g B、g D、g C、g E的基因序列的同源性和进化树构建和蛋白序列的结构功能进行预测。结果显示HBKS-IBRV分离株的g B蛋白、g D蛋白、g C蛋白、g E蛋白均为亲水蛋白并且主要二级结构为α螺旋,N-糖基化位点分别为7、3、3、2个,泛素化位点分别为14、7、6、5个;g B蛋白不含有分泌型信号肽,g D蛋白、g C蛋白、g E蛋白含有分泌型信号肽;g B蛋白、g D蛋白含有两个跨膜结构域,g C蛋白、g E蛋白含有一个跨膜结构域。