目的：宫颈癌是严重危害女性生命健康的妇科恶性肿瘤，其发病率和病死率均居全球第二位[1]。许多医疗机构将对宫颈癌根治术后患者实行新辅助化疗作为常规治疗[2]。但仍有相当一部分患者存在复发和远处转移。纠其原因，部分是因为肿瘤在发生、发展过程中演化出逃避免疫监视的方式，导致宿主不能有效清除肿瘤。有报道指出调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)可以通过抑制机体的特异性免疫作用，促进机体对肿瘤细胞的免疫耐受，帮助肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤发生[3]。叉头蛋白3(Forkhead box protein3，Foxp3)是一种叉头样转录因子，是Treg细胞的特异性标记物[4]。研究发现，肿瘤微环境中Foxp3是Tregs发育和行使功能的决定因素，可以通过抑制局部环境的免疫应答，促进肿瘤免疫逃逸[5]。最近研究发现Foxp3除了在Tregs细胞中表达，还表达于许多肿瘤细胞[6-12]。但是，肿瘤细胞表达Foxp3的调控机制尚不明确。TLR4是Toll样受体家族(Toll like receptors，TLRs)成员之一，最初发现于免疫细胞，可以通过识别某些外源性或内源性配体引发信号转导，在天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。近年来研究发现，TLR4不仅表达于免疫细胞，在很多肿瘤中也有表达[13-17]。肿瘤细胞可以通过TLR4信号通路释放多种炎性因子和免疫抑制因子，诱导免疫耐受，促进肿瘤免疫逃逸[18-19]。有文献报道应用TLR4特异性激活剂LPS可以增强Tregs的增殖能力，使Tregs发挥更强的免疫抑制作用[20-21]。因此，我们推测在宫颈癌中TLR4可能参与肿瘤细胞Foxp3的调控作用。为了探讨Foxp3和TLR4在宫颈癌发生发展中的作用及二者之间的相关性，本文采用免疫组织化学方法检测Foxp3和TLR4在正常宫颈组织、宫颈病变组织及宫颈癌组织中的表达，进一步应用Western Blotting和Realtime-PCR验证两者在正常宫颈组织及宫颈癌组织中的表达情况，进而分析Foxp3和TLR4与宫颈病变恶性程度的关系以及二者在宫颈癌组织中表达的相关性，为探讨宫颈癌免疫逃逸中Foxp3和TLR4的作用机制奠定理论基础。构建Foxp3在宫颈癌中的过表达模型，观察Foxp3过表达对T淋巴细胞增殖的影响及对TGF-β1及IL-10表达的影响。观察活化、阻断TLR4及NF-κB信号通路后Foxp3的表达变化，从而判断TLR4、Foxp3及NF-κB信号通路的关系。　　方法：⑴应用免疫组化法检测Foxp3及TLR4在35例宫颈癌、50例宫颈上皮内瘤变及20例正常宫颈组织中的蛋白表达情况，分析两者与宫颈癌患者年龄、临床分期、细胞分化程度、肿瘤大小及淋巴结转移等临床病理学参数的关系;分析在宫颈癌组织中Foxp3与TLR4表达相关性。应用Western Blotting方法检测10例正常宫颈上皮组织及30例宫颈癌组织中Foxp3及TLR4的蛋白表达情况。应用Realtime PCR方法相对定量检测30例正常宫颈上皮组织、30例宫颈癌组织中Foxp3及TLR4 mRNA的表达情况。⑵构建Foxp3基因特异性重组DNA质粒，在宫颈腺癌Hela细胞系中建立Foxp3基因高表达细胞模型;Western Blotting和Realtime PCR检测Hela细胞转染后Foxp3蛋白及mRNA的表达。应用淋巴细胞转化实验分别检测Foxp3过表达前后Hela细胞对淋巴细胞增殖的直接影响，以及Foxp3过表达的Hela细胞培养上清对T淋巴细胞增殖的影响。Realtime PCR和Elisa分别检测Hela细胞Foxp3过表达对TGF-β1和IL-10 mRNA及蛋白水平表达的影响。⑶采用TLR4特异性激活剂LPS刺激Hela细胞后，应用Realtime PCR及Western Blotting的方法检测Foxp3mRNA及蛋白水平变化。采用TLR4特异性阻断剂多粘菌素B(PMB)阻断TLR4通路后，用10 ug/ml的LPS刺激Hela细胞24 h后，通过Realtime PCR及Western Blotting的方法检测Foxp3mRNA及蛋白水平变化。应用10 ug/ml的LPS刺激Hela细胞24h后，Western Blotting检测NF-κB(p65)的蛋白表达变化。应用NF-κB通路阻断剂BAY11-7082刺激Hela细胞后，加入终浓度为10ug/ml LPS培养24小时，应用Realtime PCR及Western Blotting检测Foxp3mRNA及蛋白水平变化。　　结果：①免疫组化染色结果显示Foxp3及TLR4蛋白在正常宫颈上皮中均无阳性表达，在CIN中表达均呈弱阳性，Foxp3在宫颈癌癌灶及间质中表达明显增高，定位于细胞的细胞核和周围胞浆，呈棕黄色颗粒。TLR4在宫颈癌组织中表达主要定位于细胞浆和细胞膜，呈棕黄色。Foxp3在宫颈癌组织及宫颈病变组织中表达强度明显高于正常组织(P＜0.001，0.001)，与临床FIGO分期(P＜0.001)、肿瘤大小(P=0.034)密切相关，差异有统计学意义。TLR4在宫颈癌组织及宫颈病变组织中表达强度明显高于正常组织(P＜0.001，0.014)，与临床FIGO分期(P=0.033)、和淋巴结转移情况(P=0.012)密切相关，差异有统计学意义。Foxp3和TLR4蛋白在宫颈癌的表达相关(r=0.703，P＜0.001)。Western Blotting及RealtimePCR结果验证Foxp3及TLR4在宫颈癌组织中表达强度高于正常宫颈上皮组织。②Realtime PCR及Western Blotting验证在Hela细胞系中转染Foxp3过表达重组质粒后，Foxp3基因及蛋白的表达显著升高。与阴性对照组相比，过表达Foxp3的Hela细胞对T淋巴细胞增殖的抑制效果显著，差异具有统计学意义(P＜0.05)。进一步研究Foxp3过表达的Hela细胞培养上清对T淋巴细胞增殖的影响，发现过表达Foxp3的Hela细胞培养上清对也T淋巴细胞增殖具有明显抑制效果(P＜0.05)。Realtime PCR及Elisa结果显示，Foxp3转染组IL-10和TGF-β1 mRNA及蛋白水平的表达较空白对照组和空载组明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和空载组之间无明显变化(P＞0.05)。③Realtime PCR结果显示浓度为10μg/ml的LPS刺激Hela细胞四个时间点后Foxp3 mRNA的表达均增加，且作用24h时增加最显著(P＜0.05)，表明LPS在24 h时能够明显增加Hela细胞上Foxp3 mRNA的表达。10ug/ml LPS刺激Hela细胞24 h后，采用Western Blotting检测各组细胞中Foxp3蛋白表达水平，结果显示与未加入LPS组相比，LPS刺激组Foxp3的蛋白水平明显增加。进一步将浓度为50ug/ml的TLR4阻断剂PMB加入Hela细胞孵育1h，再用10ug/ml LPS刺激Hela细胞24小时后，检测各组细胞系中Foxp3的mRNA及蛋白表达情况，结果显示，阻断组Hela细胞系中Foxp3 mRNA及蛋白表达情况较与未阻断组降低，且差异具有统计学意义。10ug/ml LPS刺激Hela细胞24h后p65蛋白的表达较未刺激组明显增高。加入NF-κB通路阻断剂BAY11-7082的Hela细胞系经10ug/ml LPS刺激Hela细胞24h后检测发现Foxp3mRNA及蛋白表达均较未阻断组降低，且差异具有统计学意义。　　结论：⑴在宫颈上皮病变中，Foxp3及TLR4的表达均随着病变级别升高呈显著增加的趋势，提示两者的表达分级与宫颈癌的恶性潜能直接相关。⑵宫颈癌组织中Foxp3的表达与临床FIGO分期、肿瘤大小密切相关，TLR4的表达与临床FIGO分期和淋巴结转移情况密切相关。⑶Foxp3及TLR4在宫颈癌组织中表达正相关，表明Foxp3及TLR4可能存在某种协同作用，两者可能与宫颈癌的发展过程及免疫逃逸密切相关。⑷Hela细胞中表达的Foxp3可发挥与Tregs中表达Foxp3类似的作用，可通过上调具有免疫抑制作用的细胞因子IL-10和TGF-β1的表达来发挥对T淋巴细胞的增殖的抑制作用。⑸TLR4可通过NF-κB信号通路参与对Hela细胞上Foxp3的表达调控。