支气管哮喘是全球性的严重健康难题，全世界绝大部分国家的各年龄层的人群均可受到该疾病的不同程度的困扰，而且发病率逐年增加[1][2]。哮喘的发病机制尚不明确。变态反应、气道炎症、气道高反应性、神经等因素及其相互作用与哮喘的发病关系密切。临床上以内科保守治疗为主的治疗手段不能完全控制哮喘的发作或彻底的治愈。近年来的大量研究证明哮喘发病与支配气道的植物神经失衡密切相关，其中迷走神经为关键因素之一[3]。刺激迷走神经引起支气管收缩，这在动物实验中已经得到证明，临床上也观察到切断肺门迷走神经可使哮喘病人的症状得到明显缓解。但其治疗机制尚未明了，缺乏可靠的理论基础与实验研究。我们在前期研究中成功建立了动物的哮喘模型，并通过手术实施双侧肺门迷走神经切断术，证实了该手术治疗方法的可行性及有效性。本实验通过卵清蛋白(OVA)致敏大鼠，采用雾化吸入的方法成功制作大鼠过敏性哮喘模型，并通过HE染色验证气道哮喘发作时炎性加重及迷走切断后气道炎性减轻的情况，验证模型制作成功与否以及治疗的有效性。由于气道平滑肌收缩主要由乙酰胆碱、平滑肌、M受体三者所介导，通过Karnovsky—Roots法进行胆碱能神经染色，了解迷走神经切断后胆碱能神经的变化；通过HE染色观察同一层面平滑肌面积；通过免疫组化方法了解气道平滑肌M2、M3受体数量变化，通过观察胆碱能能神经周围嗜酸性粒细胞个数和ICAM-1(胆碱能神经与嗜酸性粒细胞粘附致M2失功能的主要因子)的表达强度，推断迷走神经切断后胆碱能神经与嗜酸性细胞粘附能力是否减弱。力求从蛋白水平研究双侧肺门迷走神经切断术治疗哮喘的有效性的机制。 目的：1.建立过敏性哮喘和去迷走治疗过敏哮喘有效的动物模型。2.从胆碱能神经、气道平滑肌、M受体变化的角度来探讨迷走神经切断治疗哮喘有效性的机制。 方法： 1.模型制作及实验方法。体重300±21g SPF级SD雄性健康大鼠40只，随机分成4组：A组(致敏哮喘后切断迷走神经组)，B组(致敏哮喘组)，C组(空白组)，D组(单纯切断迷走神经组)，每组10只。A、B组采用OVA腹腔连续注射3天后，1周后采用OVA雾化吸入，诱发哮喘发作，持续雾化一周后，A组从双侧颈部切断迷走神经，继续雾化一周后处死动物后取病理学标本(从右叶支气管开口处横切)；B组行双侧颈部迷走神经假切断术，继续雾化吸入一周后在同一解剖位置取病理学标本；C组10只，D1-D3生理盐水腹腔注射，同步雾化吸入生理盐水，第14天假切断双侧颈部迷走神经，第21天取材。D组10只，D1-D3生理盐水腹腔注射，同步雾化吸入生理盐水，第14天切断双侧颈部迷走神经，第21天取材。取大鼠右肺中叶，置于4摄氏度生理盐水漂洗，冲净血细胞等，10％甲醛固定后，常规组织脱水，石蜡包埋，常规切片(胆碱能神经染色需活组织冰冻切片)，进行免疫组化、HE、胆碱能神经染色。使用Nikon显微镜摄像系统连续拍照，采用Image—Pro Plus6.0图象分析软件对表达阳性区域进行扫描并测出每张切片8个随机视野的IOD值，取其平均值，嗜酸性粒细胞计数使用网格法计数。 2.检测指标。(1)镜下对4组肺组织HE切片进行“肺组织结构、大支气管周围淋巴组织、支气管收缩程度、支气管周围炎症细胞、血管周围炎症细胞、肺组织炎性细胞类型、血管扩张、呼吸性细支气管内粘液”进行比较。(2)24组支气管平均直径的比较。(3)镜下平滑肌面积(Area)，胆碱能神经、M2、M3受体阳性表达的IOD(integrated optical density)累积光密度值。(4)胆碱能能神经周围数量嗜酸性粒细胞数量，ICAM-1(胆碱能神经与嗜酸性粒细胞粘附主要因子)的IOD(integrated optical density)累积光密度值。 3.统计学处理 本研究采用的评价指标为连续型变量，实验设计上采用四组随机对照的方法，数据以统计软件SPSS13.0处理。四组之间各评价指标都进行正态分布检验和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐者使用多组均数间方差分析，方差不齐者或不符合正态分布使用多组基于秩次的非参数检验。凡涉及均数结果以X±S形式给出，当P<0.05时认为差异具有显著性。对于需要进行相关性检验的数据，对符合正态分布的使用pearson相关，对不符合正态分布数据使用spearman相关进行分析，当P<0.05时认为具有相关性(r<0.3不显著相关0.8>r>0.5轻微相关r>0.8显著相关r为相关系数)。 结果：1.镜下各组病理学差异见表(1)；A、B、C、D组直径分别为：444.1±37.4、293.1±30.9、447.7±45.7、452.5±44.0。B组与A、C、D组直径差异有明显统计学意义(P<0.05)，A、C、D三组差异无明显统计学意义(P>0.05)。2.各组气道同一视野下平滑肌面积，A、B、C、D四组面积(Area)值分别为0.53±0.04；0.54±0.03；0.50±0.09；0.52±0.08。四组平滑肌面积值(Area)总体均数差异无明显统计学意义(P>0.05)。3.各组胆碱能神经染色的IOD(integrated optical density)累积光密度值差异有明显统计学意义(P<0.05)，A、B、C、D各组胆碱能神经表达分别为2.44±0.16、5.16±0.44、1.24±0.61、2.57±0.30(单位为百万象素)，各组IOD值差异有明显统计学意义(P<0.05)。4.各组M2受体免疫组化阳性颗粒IOD值。A、B、C、D四组IOD值分别为3.81±0.25；3.29±0.65；1.92±0.24；1.25±0.93(单位为百万象素)，各组IOD值差异有明显统计学意义(P<0.05)。5.A、B、C、D四组M3表达的IOD值秩次分别为28.10，19.70，16.80，17.40，但总体比较各组IOD值差异无明显统计学意义(P>0.05)。6.A、B、C、D四组胆碱能神经周围平均嗜酸性粒细胞个数分别为3.8±1.9；10.8±2.3；3.2±2.0；3.1±1.5。其中B组(哮喘组)明显高于其他组P<0.05，其余三组差异无明显统计学意义(P>0.05)。7.A、B、C、D四组ICAM-1的IOD值分别为5.29±0.88；5.98±0.60；4.01±0.57；3.43±0.61。四组阳性表达IOD值总体均数差异有明显统计学意义(P<0.05)。8.胆碱能神经表达与气管直径有负相关性：P=0.00 r=—0.66；与M2、M3无相关性(P>0.05)．9.胆碱神经和EOS、胆碱神经和ICAM-1、EOS和ICAM-1有正相关性，相关系数分别为0.619、0.635、0.627。 结论： 1.成功建立过敏性哮喘和去迷走治疗过敏性哮喘有效的大鼠模型。 2.迷走神经切断治疗哮喘有效的神经机制：(1)迷走神经切断后气道胆碱能神经分布减少。(2)迷走神经切断后M2受体功能及数量均发生变化，迷走神经切断后气道嗜酸性粒细胞与胆碱能神经粘附减弱，M2受体对迷走神经释放的乙酰胆碱负反馈功能恢复，为迷走神经切断治疗哮喘有效的重要因素之一。