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胞苷主要作为核苷类药物与功能性食品的原料,市场需求量大。目前主要通过微生物直接发酵法生产,获得高产胞苷的优良菌株是发酵的前提。在对大肠杆菌调控胞苷代谢途径的研究中发现,包括udk和rihB基因在内的诸多因素对胞苷的大量合成均具有重要影响。本研究以大肠杆菌NXBG-11作为出发菌株,利用转录组学技术分析该菌株中对胞苷合成影响最大的代谢途径和关键基因;应用CRISPR-Cas9技术敲除udk和rihB基因,在摇瓶发酵条件下测定胞苷产量;通过单因素及响应面法优化了突变菌株的发酵条件,以期得到更高的胞苷发酵产量。主要研究内容和结果如下:（1）产胞苷重组大肠杆菌的转录组学分析。通过RNA-Seq技术,对野生菌E.coli K12及重组菌株E.coli NXBG-11转录测序,结果表明共有732个差异表达基因,有316个上调基因,416个下调基因,对这些差异表达基因进行GO/KEGG注释和富集分析,挖掘到与胞苷合成相关代谢途径中的显著变化基因40个,其中尿苷/胞苷激酶（udk编码）会使尿苷逆反应生成UMP,使胞苷逆反应生成CMP,核苷水解酶（rihB编码）会使胞苷降解为胞嘧啶,均不利于胞苷的积累,因此确定改造差异变化基因udk和rihB,研究对胞苷产量的影响。（2）应用CRISPR-Cas9技术构建大肠杆菌udk基因缺失突变菌株。以重组菌E.coli NXBG-11作为出发菌株,利用CRISPR-Cas9技术敲除udk基因。结果表明,成功将构建的重组质粒pTargetF-udk和udk敲除片段电转化至含pCas质粒的出发菌E.coli NXBG-1 1基因组上,引导Cas9蛋白切割udk基因,消除pTargetF-udk和pCas质粒后并进行菌落PCR鉴定,成功获得udk基因缺失突变菌株E.coli NXBG-12:经40 h摇瓶发酵后,突变菌E.coli NXBG-12与出发菌E.coli NXBG-11相比生长情况无明显差异,敲除udk基因没有对菌体生长造成影响,突变菌E.coli NXBG-12的耗糖量较出发菌提高了 1.08倍,胞苷产量提高了 1.28倍,且糖苷转化率提高了 1.19倍,udk基因的敲除能够提高胞苷产量。（3）应用CRISPR-Cas9技术构建大肠杆菌rihB基因缺失突变菌株。以突变菌E.coli NXBG-12作为出发菌株,利用CRISPR-Cas9技术敲除rihB基因。结果表明,成功将构建的重组质粒pTargetF-rihB及rihB基因敲除片段电转入含pCas质粒的E.coli NXBG-12感受态细胞中,实现rihB基因的敲除;消除pTargetF-rihB和pCas质粒后并进行菌落PCR鉴定,成功获得rihB基因缺失突变菌株E.coli NXBG-13;经40 h摇瓶发酵后,突变菌E.coli NXBG-13和出发菌E.coli NXBG-12相比生长情况无显著差异,rihB基因的缺失对菌体生长没有造成影响;突变菌E.coli NXBG-13的耗糖量与出发菌相当,但胞苷含量提高了 1.22倍,糖苷转化率提高了1.29倍,rihB基因的敲除进一步提高了胞苷产量。（4）突变菌株发酵产胞苷培养基的优化。为菌种提供合适的培养基组分才会促进其产生更多的目的产物,以突变菌E.coli NXBG-13作为发酵菌株,通过单因素实验及响应面优化实验,得到最优培养基组分配方:葡萄糖140.7 g/L,玉米浆40.74 g/L,KH2PO41.94 g/L,胞苷含量为3.01 g/L。之后将菌株E.coli NXBG-13在优化前及优化后的培养基里分别发酵,结果表明,菌株E.coli NXBG-13在优化后的培养基里菌体浓度较高,说明优化后的培养基利于菌株的生长;菌株的耗糖量增加了1.09倍,胞苷含量提高了 1.24倍,糖苷转化率提高了 1.1倍,说明优化后的培养基更有利于菌株积累胞苷,同时证明了响应面的模型选取正确。