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肺结核仍是世界上最致命的传染病之一,而利福霉素的衍生物利福平是目前治疗肺结核的一线药物。自1959年发现利福霉素以来,地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)一直作为利福霉素的工业生产菌种。在上世纪八十年代,焦瑞身等老一辈科学家发现在发酵培养基中添加0.8%的硝酸盐能显著地提高利福霉素的产量,于是他们将这一现象称为“硝酸盐效应”,并且发现这一现象在很多抗生素产生菌中都存在。随后经过四十多年的深入研究,鉴定了若干参与硝酸盐效应的基因/蛋白,其中包括一个关键的氮代谢全局调控蛋白Gln R与硝酸盐效应有关,但到目前为止该菌中感应硝酸盐信号的受体蛋白以及如何将信号传递给Gln R等科学问题仍不清楚。在本论文的第一部分中,我们通过基因敲除与回补实验以及不同培养条件下生长表型分析初步研究了地中海拟无枝酸菌U32中含有硝酸盐/亚硝酸盐感应结构域NIT的基因功能。首先,将原核生物中已报道的硝酸盐/亚硝酸盐结合蛋白的结构域序列在U32全基因组中进行搜索,找到了六个含有NIT结构域的编码基因(AMED_2491、AMED_6401、AMED_7680、AMED_8532、AMED_8544、AMED_8924),并且发现这六个基因所在的基因簇与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中的保守子是同源的,于是将这六个基因簇按编号从小到大的顺序命名为保守子cvn1-cvn6。随后,利用CRISPR-Cas12a基因敲除体系将此六个保守子依照亲缘关系并按cvn2-cvn1-cvn3-cvn6-cvn5-cvn4顺序进行无痕连续敲除,最后得到了六个累加缺失保守子的菌株,并对六个保守子突变株在不同条件和不同培养基上进行了生长表型分析。实验结果表明,在以硝酸盐为唯一氮源的固体和液体基本培养基上,cvn2-1-3-6-5和cvn2-1-3-6-5-4保守子突变不产某种位于细胞膜上脂溶性的黄色色素,但是所有突变体均能利用硝酸盐正常生长;在以甘氨酸为唯一氮源的培养基上,五敲和六敲保守子突变株能正常的生长,野生型和其他保守子突变株均不能生。接着又进一步在以不同浓度的甘氨酸为唯一氮源的液体基本培养基上测定野生型、四敲、五敲和六敲保守子突变株的生长曲线,实验结果表明,菌株的生长随着甘氨酸的浓度增高而变得越差。鉴于甘氨酸的降解是由甘氨酸代谢系统(GCV)负责的,于是我们在野生型和五敲保守子突变株中敲除了甘氨酸代谢系统,并在甘氨酸上进行了生长表型观察,实验结果表明,甘氨酸代谢系统增加了五敲保守子突变株对甘氨酸得耐受性。在本论文的第二部分中,我们还通过基因敲除与回补实验初步探讨了第二信使分子对利福霉素合成的影响。首先,我们在U32中对全局性信号分子合成的酶进行分析。随后,利用CRISPR-Cas12a基因敲除体系对含腺苷酸环化酶的编码基因(AMED_1571)、(p)pp Gpp合成酶的编码基因(AMED_5294)、含c-di-GMP合成酶结构域的编码基因(AMED_8999)基因分别进行单独敲除,并将这些突变株在本氏加80 m M KNO3培养基中发酵后测定利福霉素的产量,结果表明,这些缺失第二信使分子合成酶的突变株的利福霉素产量均有不同程度的降低,说明c AMP、(p)pp Gpp以及c-di-GMP参与利福霉素的合成。综上所述,本论文主要对NIT结构域编码基因进行了遗传学研究,发现cvn2-cvn1-cvn3-cvn6-cvn5连续五敲突变株不仅在硝酸盐上表现出菌落不产某种黄色色素,而且其甘氨酸系统的存在能够增加对甘氨酸的耐受。最后,通过遗传学实验探讨了第二信使分子c AMP、(p)pp Gpp以及c-di-GMP参与利福霉素的合成。