【摘 要】
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日本血吸虫病是一种严重危害人类健康,对公共卫生、社会经济和畜牧养殖造成严重影响的人畜共患寄生虫病,流行于亚洲,被列为发病率高、死亡率高的六大热带病之一。东毕吸虫病是另一种对人类健康和畜牧业造成严重影响的寄生虫病,主要发生在亚洲和欧洲的一些国家。两种寄生虫病的流行区存在重叠区域,同时两种寄生虫毛蚴的形态性状和运动轨迹都极为相似,传统方法难以鉴别,易对家畜日本血吸虫病的诊断造成误诊,进而影响国家层面的
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日本血吸虫病是一种严重危害人类健康,对公共卫生、社会经济和畜牧养殖造成严重影响的人畜共患寄生虫病,流行于亚洲,被列为发病率高、死亡率高的六大热带病之一。东毕吸虫病是另一种对人类健康和畜牧业造成严重影响的寄生虫病,主要发生在亚洲和欧洲的一些国家。两种寄生虫病的流行区存在重叠区域,同时两种寄生虫毛蚴的形态性状和运动轨迹都极为相似,传统方法难以鉴别,易对家畜日本血吸虫病的诊断造成误诊,进而影响国家层面的日本血吸虫病达标考核和消除计划。因此,本研究将采用实时荧光定量PCR技术中的荧光探针法,建立一种鉴别日本血吸虫病与东毕吸虫病的核酸检测方法,能够准确鉴别、区分两个虫种的混合样本,从而减少家畜因感染东毕吸虫造成的对日本血吸虫病的误诊。主要结果总结如下:（1）本研究筛选得到可用于区分日本血吸虫与东毕吸虫的靶序列,并分别制备两个虫种含检测靶序列的重组质粒。设计针对靶序列的特异性引物及Taq Man探针,建立了两个虫种的单重Quantitative Real-time PCR（q PCR）检测方法（Taq Man探针法）。两种方法对相应重组质粒的检测下限均为0.01fg/μl,对应的最低检测靶基因含量分别为2.55拷贝（日本血吸虫）和2.93拷贝（东毕吸虫）,与前后盘吸虫、大片吸虫、肝吸虫、弓形虫、住肉孢子虫、隐孢子虫、捻转血矛线虫和曼氏迭宫绦虫裂头蚴均未有交叉反应。（2）建立了可同时检测两个虫种的双重荧光q PCR检测方法（Taq Man探针法）。该方法对日本血吸虫和东毕吸虫重组质粒的标准曲线相关系数（R2）均为1.00,扩增效率（E）分别为1.91和1.89;对日本血吸虫重组质粒的最低检测下限为0.1fg/μl,最低检测靶基因含量为25.5拷贝;对东毕吸虫重组质粒的检测下限为0.1fg/μl,最低检测靶基因含量为29.3拷贝;与上述几种寄生虫虫体基因组均无交叉反应。（3）利用建立的单重q PCR检测方法,检测了单个毛蚴和单个尾蚴中的靶基因含量,日本血吸虫单个毛蚴的靶基因含量为（4.85±0.21）×10~8拷贝,单个尾蚴的靶基因含量为（5.36±0.21）×10~8拷贝;东毕吸虫单个毛蚴的靶基因含量为（5.86±0.16）×10~8拷贝,单个尾蚴的靶基因含量为（5.27±0.21）×10~8拷贝。利用建立的双重q PCR检测方法对模拟的混合毛蚴样本进行检测,结果显示该双重方法可以检出单个毛蚴、尾蚴,并能准确对日本血吸虫和东毕吸虫进行鉴别区分。（4）评估不同的保存条件（储存介质、环境温度和保存时长）对灭活处理后的毛蚴/尾蚴的影响。结果显示,保存在RNA later中的毛蚴/尾蚴在4℃、-20℃、-80℃的条件下,3天、7天、15天、30天和3个月的检出率均为100%,在-20℃、-80℃的条件下6个月以及一年后,q PCR检出率也均为100%。保存在无水乙醇中的毛蚴/尾蚴在4℃、-20℃、-80℃的条件下3天、7天、15天、30天和3个月的检出率均为100%,但保存3个月时检测的Ct值有所增加;在-20℃、-80℃的条件下6个月以及一年后,检出率均为100%。因此,4℃条件下,一个月内可选择乙醇或RNA later进行保存,长期保存可在RNA later中储存于-20℃甚至更低的温度。总之,本研究成功建立了一种可鉴别日本血吸虫和东毕吸虫的双重荧光q PCR检测方法（Taq Man探针法）,该方法具有敏感性强、特异性高的特点,能够用于混合样本中单个毛蚴/尾蚴的鉴定。
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