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猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是临床上引起腹泻的主要病毒性病原,目前控制该病原引起的腹泻主要方法是疫苗预防接种,但临床效果并不理想。对临床猪腹泻样品病原学监测发现,样品中两种以上病原共感染十分普遍。其中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)作为可引起仔猪腹泻的病原之一,临床上与PEDV共感染较常见,对上海及周边地区腹泻猪样品监测,PEDV和BVDV共感染比例较高可达10%以上。两种病原共感染是否能够协同增强致病作用,目前还没有明确的研究报导,对病原共感染的致病作用研究更少,更没有对共感染协同致病机制研究报道。本研究通过构建PEDV/BVDV共感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)细胞体外模型,分析两种病毒共感染细胞后对宿主细胞协同致病作用,解析PEDV/BVDV共感染协同增强病毒致病作用的机制。且对二者协同致病的可能机制和信号传到途径进行研究,为深入了解多病原感染能否增强猪腹泻致病作用奠定基础,也为临床防治多病原感染的猪腹泻提供参考依据。1.PEDV/BVDV共感染IPEC-J2模型建立及蛋白质组学分析本研究将PEDV、BVDV分别单独感染和共感染IPEC-J2细胞,利用RT-PCR、间接免疫荧光和WB方法进行鉴定。结果表明,PEDV、BVDV可以单独感染和共同感染IPEC-J2细胞,成功建立了PEDV/BVDV共感染细胞体外模型。在此基础上,利用串联质谱(TMT)结合LC-MS/MS技术,对PEDV、BVDV单独感染、PEDV/BVDV共感染IPEC-J2样品进行蛋白质组表达情况分析,以FC≥2.0,同时P<0.05为筛选阈值,筛选上调表达蛋白;以FC≤0.50,同时P<0.05时,筛选下调表达蛋白。结果显示PEDV、BVDV单独感染和PEDV/BVDV共感染分别检测到346、303和286个差异表达蛋白(DEPs);PEDV单独感染组上调和下调DEPs分别为143和203个;BVDV单独感染组上调蛋白和下调DEPs分别为107和196个;PEDV/BVDV共感染组上调蛋白和下调DEPs分别为93和193个。KEGG富集分析显示在与免疫相关富集程度位列前20的通路图谱中,发现PEDV/BVDV共感染导致更严重的炎症性肠病(IBD)。2.PEDV/BVDV共感染激活NF-κB通路,引起炎性因子大量释放,协同增强肠炎致病作用。NF-κB通路是调控炎性因子释放的主要信号通路,而TLR是激活NF-κB通路的关键影响因子。为此,本研究将PEDV、BVDV分别单独感染和共感染IPEC-J2细胞,在不同时间点分别收集细胞沉淀,利用荧光定量PCR检测细胞中炎症因子IL-6、IL-8、IL-18和TNF-α的转录变化。结果表明随着感染时间的延长,IL-6、IL-8、IL-18和TNF-α的转录水平逐渐上升,且与单独感染组相比,PEDV/BVDV共感染会显著上调炎症因子的转录。利用WB检测PEDV/BVDV共感染后细胞中NF-κB和IκB的表达和磷酸化水平,以及NF-κB上游信号分子TLRs(TLR2、TLR3、TLR7和TLR9)的活化情况。结果显示PEDV/BVDV共感染后能够引起IκB发生磷酸化而降解,解除其对NF-κB的抑制作用,NF-κB被激活,且活性较强,共感染能够引起TLR9表达显著上调。在此基础上,设计并筛选获得一条理想的TLR9 si RNA(si TLR9),转染细胞后可使TLR9表达量下降50%左右。si TLR9转染细胞后,p-p65和p-IκB表达量没有变化。提示PEDV/BVDV共感染可能通过激活TLR9,促进IκB磷酸化,进而激活NF-κB通路,从而促进炎症因子释放,加重肠炎病症。综上所述,本研究成功建立了PEDV/BVDV共感染细胞模型,通过蛋白质组学分析发现共感染能显著激活炎症性肠病相关蛋白的上调表达,进而引起更严重的肠道炎症反应。进一步对引起炎症性肠病机理研究发现,PEDV/BVDV共感染能够激活TLR9信号分子,促进IκB磷酸化而使IκB失活,失去抑制NF-κB功能,使得NF-κB信号通路被激活,引起炎性因子高水平释放,导致严重的炎性肠炎症状,证实了PEDV/BVDV共感染能诱导更为严重的临床炎性腹泻症状。