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研究目的和背景
头颈癌(HNC)为世界上的第七大最常见的癌症。其发生率占所有癌症的3％。其中头颈鳞状细胞癌(HNSCC)在头颈癌症中占主要的病理类型，约占头颈细胞癌总发生率的90％。在头颈鳞状细胞癌之中，下咽鳞状细胞癌(HSCC)，喉鳞状细胞癌(LSCC)以及食管鳞状细胞癌(ESCC)在头颈鳞状细胞癌的发生中占据很大比例。HSCC占头颈癌的3％，难以诊断且预后非常差，一般发现时常常处于中晚期，其5年总生存率仅为30-35％左右。LSCC是头颈鳞癌中发病率最高的癌症，按照发病部位的不同，其主要分为声门型、声门上型以及声门下型，其中声门型是最常见的类型。食管癌是世界上最常见的癌症之一。在食管癌的发病类型之中，食管鳞状细胞癌是占食管癌发病比例最高的类型，同时，ESCC也是中国食管癌发病类型中占最高比例的类型。食管癌疾病的主要特征是其预后较差，近年来，虽然医疗水平的不断提高，但是，其五年生存率仍然很低。这三种类型的癌症共同点为通常分化较差，并且下咽癌和食管癌极易发生早期的淋巴结转移。尽管近年来外科手术方法和放射疗法的发展大大改善了这些患者的生存率和生活质量，但食管癌的五年生存率仍然较低。喉癌和下咽癌患者状况也不容乐观。因此，目前迫切需要深入探讨下咽癌，喉癌和食管癌的发病机制，并寻求改善患者预后并提高长期生存率的策略。
G蛋白偶联受体12(GPR12)为G蛋白家族的一种孤儿受体，其属于G蛋白偶联受体(GPCR)中的A类家族。GPR12的人类序列包含有334个氨基酸，与GPR3和GPR6的序列同一性约为60％，这表明它们可能存在相似的配体和功能。在过去的研究中，人们发现GPR12，GPR3和GPR6在神经系统中含量很高，并且与许多中枢神经系统(CNS)疾病的发病机理密切相关。已有先前的研究证明，GPR3、GPR6和GPR12的异常表达与阿尔兹海默症、帕金森综合征等疾病的发病密切相关。此外，GPR3和GPR12已经被证明可以在啮齿动物卵母细胞中，具有阻滞减数分裂的功能。并且，在不同的细胞系中，GPR12的表达量以及作用大相径庭，其在神经系统疾病发病机理已有大量文献报道，但是，GPR12在头颈癌症中的功能和机制目前尚不清楚。
因此，本实验的目的是研究GPR12在下咽癌，喉癌和食管癌癌组织的相对表达情况，以及通过体外实验，探究GPR12对下咽癌，喉癌和食管癌细胞系，Fadu、Hep2和Eca109细胞系迁移、增殖、周期、凋亡等的作用，以及其可能的机制。
研究方法
本实验通过应用TCGA和GEO数据库的信息，探讨GPR12在下咽癌、喉癌和食管癌等头颈部肿瘤的表达情况。通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测GPR12在三种癌组织中的表达以验证GPR12在几种癌症中的差异性表达情况。之后，我们进行细胞功能学实验研究GPR12在三种肿瘤细胞系中相应的组织功能。进行划痕实验和transwell实验以探讨高表达GPR12对三种肿瘤细胞迁移的作用。进行流式细胞术分析实验和Caspase-Glo(@)3/7实验以研究高表达GPR12对几种细胞系的凋亡的影响。通过GSEA数据库的分析，我们研究GPR12与肿瘤相关进展基因之间的相互作用，最后我们通过Westernblot技术，对高表达GPR12基因的下咽癌，喉癌以及食管癌细胞的EMT相关蛋白，凋亡相关蛋白进行检测，从而验证实验结果。
研究结果
1，通过在TCGA和GEO数据库对GPR12的分析，我们发现GPR12在下咽癌，喉癌，食管癌等头颈部癌症组织相对于其癌旁正常黏膜组织中表达下调。并且，GPR12相对于其相应的癌旁正常黏膜细胞在所有癌症中的整体表达量下降。
2，我们进一步进行了实时定量PCR的实验，研究组织标本中GPR12在下咽癌，喉癌和食管癌中相对表达情况。结果分析显示，在18对下咽癌组织中，17对下咽癌组织GPR12表达量显著的下降。在12对喉癌组织标本中，相对于癌旁正常黏膜组织，10对喉癌组织GPR12的相对表达量下降。11对食管癌组织cDNA芯片中，10对食管癌cDNA芯片GPR12相对表达量下降。
3，接下来，我们研究了高表达GPR12对下咽癌，喉癌和食管癌细胞功能的影响。我们通过划痕实验以及Transwell实验研究GPR12对细胞迁移的作用。划痕实验和Transwell实验的结果均显示高表达GPR12可以明显抑制下咽癌Fadu细胞，喉癌Hep2细胞以及食管癌Eca109细胞的迁移能力。我们通过流式细胞仪凋亡检测和Caspase-Glo(@)3/7实验研究高表达GPR12对细胞凋亡的影响。通过流式细胞检测结果分析，我们发现高表达GPR12可以明显促进Fadu、Hep2和Eca109细胞的凋亡，同样，Caspase-Glo(@)3/7实验结果显示，高表达GPR12可以促进Fadu、Hep2和Eca109细胞Caspase-Glo(@)3/7酶活性增加，进而导致细胞凋亡数目增多。另外，为了研究高表达GPR12对下咽癌，喉癌和食管癌细胞周期和增殖的影响，我们应用流式细胞仪检测高表达GPR12对几种细胞周期的影响，使用CCK-8试剂盒检验高表达GPR12与下咽癌、喉癌和食管癌细胞增殖的关系。结果分析显示，高表达GPR12的Fadu，Hep2和Eca109的细胞，相比较正常对照细胞，细胞周期无明显变化。高表达GPR12的Fadu，Hep2和Eca109细胞与对应对照细胞相比，细胞增殖速率相差无几。
4，在机制上，我们通过GSEA数据库分析，研究GPR12与肿瘤发生和进展的相关蛋白的作用，发现GPR12与EMT相关基因呈负相关，同时，也和肿瘤相关蛋白MTORC1、MYC、DNArepair和TNFa基因呈负相关。
5，因此，我们进一步研究GPR12的功能机制。通过westernblot实验，我们发现GPR12可以促进下咽癌，喉癌和食管癌细胞EMT相关蛋白E-cadherin和α-catenin的表达，从而抑制细胞的迁移。同时，GPR12可以促进下咽癌，喉癌和食管癌细胞活化caspase-7的表达，从而促进细胞凋亡。
研究结论和意义
综上所述，GPR12通过激活caspase-7诱导凋亡，并通过促进下咽癌，喉癌和食管癌细胞的EMT相关蛋白E-cadherin和α-catenin的表达抑制下咽癌，喉癌和食管癌细胞的迁移。我们的研究结果表明，GPR12作为潜在的肿瘤因子介导下咽癌，喉癌和食管癌细胞的迁移和凋亡。同时，为下咽癌，喉癌和食管癌的治疗方式提供新的分子的靶点。
头颈癌(HNC)为世界上的第七大最常见的癌症。其发生率占所有癌症的3％。其中头颈鳞状细胞癌(HNSCC)在头颈癌症中占主要的病理类型，约占头颈细胞癌总发生率的90％。在头颈鳞状细胞癌之中，下咽鳞状细胞癌(HSCC)，喉鳞状细胞癌(LSCC)以及食管鳞状细胞癌(ESCC)在头颈鳞状细胞癌的发生中占据很大比例。HSCC占头颈癌的3％，难以诊断且预后非常差，一般发现时常常处于中晚期，其5年总生存率仅为30-35％左右。LSCC是头颈鳞癌中发病率最高的癌症，按照发病部位的不同，其主要分为声门型、声门上型以及声门下型，其中声门型是最常见的类型。食管癌是世界上最常见的癌症之一。在食管癌的发病类型之中，食管鳞状细胞癌是占食管癌发病比例最高的类型，同时，ESCC也是中国食管癌发病类型中占最高比例的类型。食管癌疾病的主要特征是其预后较差，近年来，虽然医疗水平的不断提高，但是，其五年生存率仍然很低。这三种类型的癌症共同点为通常分化较差，并且下咽癌和食管癌极易发生早期的淋巴结转移。尽管近年来外科手术方法和放射疗法的发展大大改善了这些患者的生存率和生活质量，但食管癌的五年生存率仍然较低。喉癌和下咽癌患者状况也不容乐观。因此，目前迫切需要深入探讨下咽癌，喉癌和食管癌的发病机制，并寻求改善患者预后并提高长期生存率的策略。
G蛋白偶联受体12(GPR12)为G蛋白家族的一种孤儿受体，其属于G蛋白偶联受体(GPCR)中的A类家族。GPR12的人类序列包含有334个氨基酸，与GPR3和GPR6的序列同一性约为60％，这表明它们可能存在相似的配体和功能。在过去的研究中，人们发现GPR12，GPR3和GPR6在神经系统中含量很高，并且与许多中枢神经系统(CNS)疾病的发病机理密切相关。已有先前的研究证明，GPR3、GPR6和GPR12的异常表达与阿尔兹海默症、帕金森综合征等疾病的发病密切相关。此外，GPR3和GPR12已经被证明可以在啮齿动物卵母细胞中，具有阻滞减数分裂的功能。并且，在不同的细胞系中，GPR12的表达量以及作用大相径庭，其在神经系统疾病发病机理已有大量文献报道，但是，GPR12在头颈癌症中的功能和机制目前尚不清楚。
因此，本实验的目的是研究GPR12在下咽癌，喉癌和食管癌癌组织的相对表达情况，以及通过体外实验，探究GPR12对下咽癌，喉癌和食管癌细胞系，Fadu、Hep2和Eca109细胞系迁移、增殖、周期、凋亡等的作用，以及其可能的机制。
研究方法
本实验通过应用TCGA和GEO数据库的信息，探讨GPR12在下咽癌、喉癌和食管癌等头颈部肿瘤的表达情况。通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测GPR12在三种癌组织中的表达以验证GPR12在几种癌症中的差异性表达情况。之后，我们进行细胞功能学实验研究GPR12在三种肿瘤细胞系中相应的组织功能。进行划痕实验和transwell实验以探讨高表达GPR12对三种肿瘤细胞迁移的作用。进行流式细胞术分析实验和Caspase-Glo(@)3/7实验以研究高表达GPR12对几种细胞系的凋亡的影响。通过GSEA数据库的分析，我们研究GPR12与肿瘤相关进展基因之间的相互作用，最后我们通过Westernblot技术，对高表达GPR12基因的下咽癌，喉癌以及食管癌细胞的EMT相关蛋白，凋亡相关蛋白进行检测，从而验证实验结果。
研究结果
1，通过在TCGA和GEO数据库对GPR12的分析，我们发现GPR12在下咽癌，喉癌，食管癌等头颈部癌症组织相对于其癌旁正常黏膜组织中表达下调。并且，GPR12相对于其相应的癌旁正常黏膜细胞在所有癌症中的整体表达量下降。
2，我们进一步进行了实时定量PCR的实验，研究组织标本中GPR12在下咽癌，喉癌和食管癌中相对表达情况。结果分析显示，在18对下咽癌组织中，17对下咽癌组织GPR12表达量显著的下降。在12对喉癌组织标本中，相对于癌旁正常黏膜组织，10对喉癌组织GPR12的相对表达量下降。11对食管癌组织cDNA芯片中，10对食管癌cDNA芯片GPR12相对表达量下降。
3，接下来，我们研究了高表达GPR12对下咽癌，喉癌和食管癌细胞功能的影响。我们通过划痕实验以及Transwell实验研究GPR12对细胞迁移的作用。划痕实验和Transwell实验的结果均显示高表达GPR12可以明显抑制下咽癌Fadu细胞，喉癌Hep2细胞以及食管癌Eca109细胞的迁移能力。我们通过流式细胞仪凋亡检测和Caspase-Glo(@)3/7实验研究高表达GPR12对细胞凋亡的影响。通过流式细胞检测结果分析，我们发现高表达GPR12可以明显促进Fadu、Hep2和Eca109细胞的凋亡，同样，Caspase-Glo(@)3/7实验结果显示，高表达GPR12可以促进Fadu、Hep2和Eca109细胞Caspase-Glo(@)3/7酶活性增加，进而导致细胞凋亡数目增多。另外，为了研究高表达GPR12对下咽癌，喉癌和食管癌细胞周期和增殖的影响，我们应用流式细胞仪检测高表达GPR12对几种细胞周期的影响，使用CCK-8试剂盒检验高表达GPR12与下咽癌、喉癌和食管癌细胞增殖的关系。结果分析显示，高表达GPR12的Fadu，Hep2和Eca109的细胞，相比较正常对照细胞，细胞周期无明显变化。高表达GPR12的Fadu，Hep2和Eca109细胞与对应对照细胞相比，细胞增殖速率相差无几。
4，在机制上，我们通过GSEA数据库分析，研究GPR12与肿瘤发生和进展的相关蛋白的作用，发现GPR12与EMT相关基因呈负相关，同时，也和肿瘤相关蛋白MTORC1、MYC、DNArepair和TNFa基因呈负相关。
5，因此，我们进一步研究GPR12的功能机制。通过westernblot实验，我们发现GPR12可以促进下咽癌，喉癌和食管癌细胞EMT相关蛋白E-cadherin和α-catenin的表达，从而抑制细胞的迁移。同时，GPR12可以促进下咽癌，喉癌和食管癌细胞活化caspase-7的表达，从而促进细胞凋亡。
研究结论和意义
综上所述，GPR12通过激活caspase-7诱导凋亡，并通过促进下咽癌，喉癌和食管癌细胞的EMT相关蛋白E-cadherin和α-catenin的表达抑制下咽癌，喉癌和食管癌细胞的迁移。我们的研究结果表明，GPR12作为潜在的肿瘤因子介导下咽癌，喉癌和食管癌细胞的迁移和凋亡。同时，为下咽癌，喉癌和食管癌的治疗方式提供新的分子的靶点。