水产品辐照加工鉴别方法研究

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水产品是味道鲜美、高营养价值的优质动物性食品,其在膳食中的地位日益重要。相比肉类食品,水产品更适合微生物的生长繁殖,而且加工过程也会造成微生物的污染。因此,必须采用恰当的工艺技术对水产品进行灭菌处理,以防止食源性疾病的发生。辐照就是目前一项理想的冷杀菌工艺,在国内外水产品加工方面已有运用。但是对于高剂量辐照存在的潜在危害尚存争议,而且现有的辐照食品检测方法各自的适用范围不尽相同。因此,开发水产品辐照加工的鉴别方法具有非常重要的意义。本文选择带鱼和市售醉蟹钳为研究对象,研究了其辐照加工后的微生物变化以及辐照后特异性标记物邻酪氨酸的检测方法,以期为辐照水产品的鉴定提供依据。   在辐照水产品微生物变化和鉴别方法研究中,以带鱼和醉蟹钳为材料,研究了4.0kGy剂量60Coγ射线辐照后样品的微生物状况。借鉴国标中的菌落总数计数法、大肠杆菌MPN计数法,考察辐照对样品中微生物的控制效果。辐照组样品在PAC培养基上的生长情况明显比空白组弱。表明4.0kGy剂量的辐照处理对冷冻带鱼和醉蟹钳具有明显的杀菌效果。利用LIVE/DEAD Baclight荧光染色技术(活/死微生物存活性荧光染色技术),观察带鱼中的微生物总体情况(包括已死亡的微生物),该方法较好地体现了辐照对带鱼的杀菌效果。以苏丹黑B染色的混合纤维素微孔滤膜代替聚碳酸酯膜,在荧光显微镜观测时能较好地排除背景干扰。将LIVE/DEAD值作为考察样品微生物状况的指标,并根据该指标鉴定样品是否经过辐照。实验结果显示,10-2稀释度下该指标的检测值可以鉴别4.0kGy剂量的辐照带鱼。   在蛋白质类辐照食品特异性标记物鉴别方法的研究中,以带鱼为研究对象,优化样品提取方法和液相检测条件,建立了辐照特异性标记物邻酪氨酸的高效液相色谱(HPLC)检测方法,同时以样品中两种酪氨酸含量的比值与辐照剂量的关系作为评价指标,用于鉴别辐照加工的带鱼。以甲酸水溶液作提取溶剂提取带鱼肌肉中的游离酪氨酸,获得了较为理想的提取效果;流动相中加入0.2%甲酸,很好地改善了峰型,各目标物质间实现基线分离。经方法学验证:三种酪氨酸异构体在16-4100ng/mL的线性范围内具有良好的线性关系(R2=0.9997-0.9999)。检出限(LOD)在16.6-21.0ng/mL之间,对酪氨酸和邻酪氨酸的样品加标回收率分别在66.1-70.9%和62.8-68.7%之间。以邻酪氨酸和对酪氨酸的比值(O/P值)作为参考指标,在对带鱼的检测中,该指标能区分4.0kGy以及更高剂量的辐照处理,且O/P值随着辐照剂量的增大(4.0-8.0kGy)而升高。结果表明,该指标可以用于鉴定辐照剂量大于等于4.0kGy的带鱼。   同样以带鱼为研究对象,建立了辐照特异性标记物邻酪氨酸的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法,以样品中两种酪氨酸含量的比值与辐照剂量的关系作为评价指标,用于鉴别辐照加工的带鱼。UPLC能高效快速地分离三种酪氨酸异构体,分析速度比HPLC提高了4倍。串联质谱的多离子反应监测(MRM)模式,提高了检测的准确度和灵敏度。采用空白基质加标方法,有效地降低了基质干扰,进一步提高了灵敏度。经方法学验证:对酪氨酸和邻酪氨酸的定量限(LOQ)分别为:1.05ng/mL和1.79ng/mL,分别在0.670-1320ng/mL和1.15-920ng/mL的线性范围内线性相关性良好(R2=0.9995-0.9999)。分别在132-924ng/mL和14.8-150ng/mL的加标浓度下,回收率达到64.8%-82.7%,相对标准偏差(RSD)在2.08%-8.29%之间。该方法灵敏度高、定量准确、适用于鱼类水产品中辐照标记物邻酪氨酸的分析检测。邻酪氨酸和对酪氨酸含量的比值可用于鉴定样品是否经过辐照加工。   最后,本研究比较了UPLC-MS/MS和HPLC-FLD的检测方法。HPLC-MS/MS法比HPLC-FLD法分析速度更快、准确度和灵敏度更高。适用于水产品中酪氨酸及其异构体的定性、定量检测以及辐照冷冻带鱼吸收剂量的估测。HPLC-FLD的分析价格比UPLC-MS/MS分析便宜,可用于4.0kGy剂量以上辐照冷冻水产品的分析鉴定。   综上所述,4.0kGy剂量的辐照对带鱼和醉蟹钳有明显的杀菌效果,LIVE/DEAD Baclight检测法可用于鉴定4.0kGy剂量以上带鱼的辐照加工。本文建立的辐照特异性标记物邻酪氨酸的HPLC-FLD和UPLC-MS/MS检测方法适用于鱼类水产品的辐照加工的鉴定和吸收剂量评估。
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