论文部分内容阅读
目的:通过体外细胞实验,检测顺铂(cisdiamminodichloroplatinumⅡdichloride,cisplatin,DDP)干预人肺腺癌A549细胞后细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、程序性死亡配体1(Programmed death ligand-1,PD-L1)的表达,从而探究DDP对人肺腺癌A549细胞PD-L1表达的影响及其可能的机制,为DDP联合免疫治疗提供理论基础。
方法:1.CCK-8法分别检测不同浓度DDP(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L,2mg/L、4mg/L、8mg/L)干预A549细胞不同时间(24h、36h、48h)后的光密度(optical density,OD)值,并分别计算其增殖抑制率及半数抑制浓度(50%maximal inhibitory concentration,IC50),选择最适时间48h的及最适IC50值用于后续实验;2.流式细胞术检测PD-L1的表达,分组:为检测不同浓度DDP对PD-L1的影响,分为不同浓度组(0、0.5、1、2、4、8)mg/L的DDP,为探究ERK通路抑制剂PD98059对人肺腺癌A549细胞PD-L1的影响,分为对照组、DDP组、PD98059组、DDP联合PD98059组,对照组加入培养液,DDP组加入IC50浓度的DDP、PD98059组加入20umol/LPD98059、DDP联合PD98059组加入20umol/L的PD98059及IC50浓度的DDP,分别干预48h,用流式细胞术检测其PD-L1的表达;3.蛋白免疫印迹杂交法(Western Blot)检测各组细胞中ERK、p-ERK表达水平:根据前期实验结果分为对照组、DDP组、PD98059组、DDP联合PD98059组,干预48h后用Western Blot法分别检测各组细胞中ERK、p-ERK蛋白表达水平,并比较各组之间ERK、p-ERK表达的差异。
结果:1.不同浓度(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L,2mg/L、4mg/L、8mg/L)DDP干预A549细胞,24h细胞增殖抑制率分别为:0%、(2.684±0.995)%、(5.614±1.229)%、(18.989±2.062)%、(24.256±2.828)%、(39.83±2.969)%,各组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),36h增殖抑制率分别为:0%、(4.373±1.296)%、(8.855±2.355)%、(23.88±3.057)%、(39.995±3.365)%、(54.19±2.6)%,各组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),48h增殖抑制率分别为:0%、(5.082±2.793)%、(10.019±3.77)%、(30.426±2.533)%、(56.189±3.165)%、(75.522±4.216)%,各组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),不同时间点之间对比,除DDP0mg/L组外,各实验组的增殖抑制率差异具有统计学差异(P<0.05)。经计算后得到DDP干预24h、36h、48h的IC50值为分别为:11.244mg/L、6.247mg/L、3.586mg/L,选择48小时及3.586mg/L作为最适干预时间和最适干预IC50用于后续实验;2.不同浓度组(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L)DDP作用于A549细胞48h后PD-L1阳性细胞表达率分别为:(39.87±1)%、(42.77±0.85)%、(51.87±2.05)%、(62.03±1.31)%、(70.47±0.21)%、(75.8±1.85)%,各组间对比均有统计学意义(P<0.05)。对照组、DDP组、PD98059组、DDP+PD98059组干预A549细胞48h后PD-L1阳性细胞表达率分别为:(40.23±2.07)%、(67.07±1.31)%、(38.77±1.69)%、(52.57±1.01)%,与对照组相比,DDP组、DDP+PD98059组的PD-L1表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),PD98059单药组与对照组相比无统学意义(P>0.05);DDP+PD98059组较DDP组的PD-L1的表达降低,较PD98059组的PD-L1表达增加(P<0.05)。3.对照组、DDP组、PD98059组、DDP+PD98059组各组之间的ERK相对蛋白表达分别为:1.26±0.13、1.27±0.16、1.27±0.12、1.28±0.14,各组之间无统计学差异(P>0.05),各组p-ERK相对蛋白表达分别为:0.29±0.02、0.74±0.02、0.23±0.02、0.49±0.05;与对照组比较,DDP组、DDP联合PD98059组的p-ERK上调,PD98059组的p-ERK下调(P<0.05);DDP联合PD98059组较DDP组的p-ERK下调,但较PD98059组的p-ERK上调(P<0.05)。
结论:1.顺铂对A549细胞的增殖抑制作用在一定范围内呈时间剂量依赖性;2.顺铂上调人肺腺癌A549细胞株PD-L1的表达在一定范围内呈浓度依赖性;3.顺铂可以通过激活ERK通路上调人肺腺癌A549细胞株PD-L1表达。
方法:1.CCK-8法分别检测不同浓度DDP(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L,2mg/L、4mg/L、8mg/L)干预A549细胞不同时间(24h、36h、48h)后的光密度(optical density,OD)值,并分别计算其增殖抑制率及半数抑制浓度(50%maximal inhibitory concentration,IC50),选择最适时间48h的及最适IC50值用于后续实验;2.流式细胞术检测PD-L1的表达,分组:为检测不同浓度DDP对PD-L1的影响,分为不同浓度组(0、0.5、1、2、4、8)mg/L的DDP,为探究ERK通路抑制剂PD98059对人肺腺癌A549细胞PD-L1的影响,分为对照组、DDP组、PD98059组、DDP联合PD98059组,对照组加入培养液,DDP组加入IC50浓度的DDP、PD98059组加入20umol/LPD98059、DDP联合PD98059组加入20umol/L的PD98059及IC50浓度的DDP,分别干预48h,用流式细胞术检测其PD-L1的表达;3.蛋白免疫印迹杂交法(Western Blot)检测各组细胞中ERK、p-ERK表达水平:根据前期实验结果分为对照组、DDP组、PD98059组、DDP联合PD98059组,干预48h后用Western Blot法分别检测各组细胞中ERK、p-ERK蛋白表达水平,并比较各组之间ERK、p-ERK表达的差异。
结果:1.不同浓度(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L,2mg/L、4mg/L、8mg/L)DDP干预A549细胞,24h细胞增殖抑制率分别为:0%、(2.684±0.995)%、(5.614±1.229)%、(18.989±2.062)%、(24.256±2.828)%、(39.83±2.969)%,各组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),36h增殖抑制率分别为:0%、(4.373±1.296)%、(8.855±2.355)%、(23.88±3.057)%、(39.995±3.365)%、(54.19±2.6)%,各组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),48h增殖抑制率分别为:0%、(5.082±2.793)%、(10.019±3.77)%、(30.426±2.533)%、(56.189±3.165)%、(75.522±4.216)%,各组间对比差异具有统计学意义(P<0.05),不同时间点之间对比,除DDP0mg/L组外,各实验组的增殖抑制率差异具有统计学差异(P<0.05)。经计算后得到DDP干预24h、36h、48h的IC50值为分别为:11.244mg/L、6.247mg/L、3.586mg/L,选择48小时及3.586mg/L作为最适干预时间和最适干预IC50用于后续实验;2.不同浓度组(0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L)DDP作用于A549细胞48h后PD-L1阳性细胞表达率分别为:(39.87±1)%、(42.77±0.85)%、(51.87±2.05)%、(62.03±1.31)%、(70.47±0.21)%、(75.8±1.85)%,各组间对比均有统计学意义(P<0.05)。对照组、DDP组、PD98059组、DDP+PD98059组干预A549细胞48h后PD-L1阳性细胞表达率分别为:(40.23±2.07)%、(67.07±1.31)%、(38.77±1.69)%、(52.57±1.01)%,与对照组相比,DDP组、DDP+PD98059组的PD-L1表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),PD98059单药组与对照组相比无统学意义(P>0.05);DDP+PD98059组较DDP组的PD-L1的表达降低,较PD98059组的PD-L1表达增加(P<0.05)。3.对照组、DDP组、PD98059组、DDP+PD98059组各组之间的ERK相对蛋白表达分别为:1.26±0.13、1.27±0.16、1.27±0.12、1.28±0.14,各组之间无统计学差异(P>0.05),各组p-ERK相对蛋白表达分别为:0.29±0.02、0.74±0.02、0.23±0.02、0.49±0.05;与对照组比较,DDP组、DDP联合PD98059组的p-ERK上调,PD98059组的p-ERK下调(P<0.05);DDP联合PD98059组较DDP组的p-ERK下调,但较PD98059组的p-ERK上调(P<0.05)。
结论:1.顺铂对A549细胞的增殖抑制作用在一定范围内呈时间剂量依赖性;2.顺铂上调人肺腺癌A549细胞株PD-L1的表达在一定范围内呈浓度依赖性;3.顺铂可以通过激活ERK通路上调人肺腺癌A549细胞株PD-L1表达。