本文研究目的：寻找一种体外快速构建复合型组织工程化自体皮肤的可行方法，为大面积烧创伤创面的覆盖快速提供足够的自体皮肤。 研究方法：含表皮干细胞的表皮细胞群的分离(三种分离方法的比较)：分别应用Ⅰ型胶原酶法、胰蛋白酶法及中性蛋白酶法，进行人皮肤组织表皮细胞群的分离。前者分离所得的表皮层及后两者分离表皮层后的真皮层，均进行组织学切片，苏木素-伊红(H-E)染色观察，三者所得表皮细胞群均经流式细胞仪检测其中角蛋白19(K19)阳性细胞的百分比。含表皮干细胞的表皮细胞群的鉴定及培养：Ⅰ型胶原酶法分离的表皮细胞群，分别进行K19-异硫氰酸荧光素(FITC)及β1-整合素(integrin)-氰3(Cy3)免疫荧光鉴定，克隆形成率试验，并对比培养基添加角质细胞生长因子(KGF)与否对表皮细胞群生长曲线的影响，应用丝裂霉素-C处理后的人成纤维细胞饲养层培养表皮细胞群，观察其体外增殖情况。成纤维细胞的分离培养及鉴定：Ⅰ型胶原酶法分离表皮细胞时的消化剩液经过滤离心后，所得细胞进行体外扩增培养，光镜下观察形态，并行波形蛋白(vimentin)-FITC免疫荧光鉴定。复合型组织工程化自体皮肤的构建：表皮细胞群以1×105个/cm2直接接种于脱细胞真皮基质(ADM)的乳头面，约第7天时，翻转ADM再接种已扩增的成纤维细胞，收集标本进行组织学切片H-E染色，表皮层细胞计数，设培养基添加KGF组及不添加组。构建皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损的初步实验：构建皮肤移植于裸鼠背部全层皮肤缺损创面，设三组对照，对照一：裸鼠自体全厚皮片移植(将背部一侧取下皮肤移植于另一侧)，对照二：单纯ADM移植，对照三：裸露创面不做修复。修复后约6周，收集实验组创区皮肤，进行组织学切片H-E染色，抗人角蛋白10(K10)-FITC及K19-FITC免疫荧光检测。 研究结果：Ⅰ型胶原酶法分离所得的表皮细胞群中K19阳性表达的细胞最高可接近17％，比胰蛋白酶法及中性蛋白酶法高。表皮细胞群中，K19-FITC及β1-integrin-Cy3免疫荧光鉴定显示有K19阳性及β1-integrin较高表达的细胞，其克隆形成率介于1％-8％之间；表皮细胞单纯体外培养困难，添加KGF后，增殖较快，且分化有所减缓，但仍渐分化成复层，并脱落；人成纤维细胞饲养层培养的表皮细胞群，于约第3天时开始出现克隆样增殖，并渐出现复层化，经几次换液后，复层化细胞脱落，残留细胞开始呈现单层克隆样增殖，于约14天时渐推开成纤维细胞，形成融合，但仍无法维持继续传代。Ⅰ型胶原酶法分离表皮细胞时，可同期获得成纤维细胞，体外培养扩增较容易，约7天左右即可扩增100倍，vimentin-FITC免疫荧光染色呈阳性染色。利用先期接种表皮细胞于ADM，再接种已扩增的成纤维细胞，并应用添加KGF的条件培养基培养，可以快速构建出超过30倍于原取材面积的皮肤，表皮层连续，细胞层数多为2-3层，部分分层较好，表皮层与真皮层之间的粘着均不紧密，真皮中含有成纤维细胞；表皮层细胞计数显示，KGF添加组细胞计数明显高于未添加组。所构建皮肤能够较好的修复皮肤缺损创面，创区皮肤表皮层分层好，均有3-4层细胞覆盖，真皮层胶原排列有序，成纤维细胞分布均匀，未见皮肤附属器，与裸鼠自体全厚皮片移植修复后的皮肤组织结构基本接近；抗人K10-FITC免疫荧光显示创区表皮层，绝大部分细胞呈绿色的阳性染色，抗人K19-FITC免疫荧光显示仅有极个别基底层细胞呈绿色的阳性染色。 研究结论：利用胶原酶消化法，以及添加KGF的条件培养基，采用分步接种法，可以在体外短期内(约8天)构建出足够可用(约30倍于取材面积)的复合型组织工程化自体皮肤，这可能为临床上严重烧创伤创面的覆盖解决了皮源问题。