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背景和目的肺癌是中国乃至全世界死亡率最高的恶性肿瘤,其中绝大多数属于非小细胞肺癌（none small cell lung cancer,NSCLC）。目前对其治疗主要为包括手术、化疗、放疗、靶向药物治疗、免疫治疗等的综合治疗,但患者5年生存率仍较低。肿瘤的发生发展与免疫微环境密切相关,NSCLC也不例外。近年来,免疫检查点治疗在NSCLC中取得不错的疗效,这正是由于改善了肿瘤微环境中的免疫细胞功能。肿瘤微环境由癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞及细胞外基质等组成。其中,肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境中一种重要的免疫调节细胞,在调控肿瘤免疫抑制微环境及肿瘤发生进展方面起着关键作用。TAMs具有极大的可塑性,可以极化为促炎、抗肿瘤的M1型巨噬细胞,也可极化为抗炎、促肿瘤的M2型巨噬细胞。通常认为TAMs大多表现为M2型巨噬细胞表型及功能,但可通过干预使其向M1型极化并恢复抗肿瘤能力,抑制肿瘤生长。因此,本课题旨在通过筛选NSCLC中M1型与M2型巨噬细胞差异表达基因,明确TAMs免疫抑制作用的关键调控分子。利用构建敲低细胞系和阻断型抑制剂等技术手段,在分子水平、细胞水平和动物肿瘤模型中,探究该关键差异分子调控TAMs免疫抑制作用的重要机制,并观察靶向相关通路后的抗肿瘤疗效,为临床NSCLC患者治疗提供新的措施及手段。方法1.利用GEO数据库中关于M1型及M2型巨噬细胞的RNA-Seq数据,分析寻找差异基因。2.利用实时荧光定量PCR（quantitativereal-time PCR,qPCR）验证差异基因在M1型和M2型巨噬细胞的表达情况。3.利用单细胞测序分析FN1基因（编码蛋白为Fibronectin）在NSCLC各类细胞群中的表达情况,及各类细胞所表达标志性分子。4.利用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测NSCLC癌及癌旁组织中Fibronectin阳性细胞群中巨噬细胞比例,并检测CD163+和CD163-巨噬细胞中Fibronectin表达情况。5.利用流式细胞荧光分选技术（fluorescence-activated cell sorting,FACS）分选出NSCLC癌组织中的CD163+及CD163-巨噬细胞,并通过RNA-Seq及qPCR检测FN1基因的表达情况;并利用免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测癌组织中的CD163高表达及低表达细胞周围Fibronectin表达情况。6.对体外人外周血单核细胞诱导的M1型和M2型巨噬细胞,利用qPCR检测FN1基因及巨噬细胞功能指标的表达情况,并利用免疫印迹（western blot,WB）及成像流式细胞术（imaging flow cytometry,IFC）检测 Fibronectin 的表达情况。7.人外周血单核细胞诱导为M2型巨噬细胞,添加Fibronectin inhibitor（FI）处理后,利用FCM检测巨噬细胞表型及功能。8.利用shRNA干扰慢病毒载体构建THP-1 sh NC及sh FN1（sh 9-2及sh 10-1）细胞系,通过WB及qPCR检测敲低效率;将其用M2型巨噬细胞诱导方法诱导后,利用qPCR及FCM检测巨噬细胞表型及功能。9.对诱导后的THP-1 shNC及sh FN1细胞进行RNA-Seq,对差异基因进行GO及KEGG分析。10.对诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞,利用IF检测F-actin的表达情况;利用qPCR及WB检测PFKP的表达情况。11.对添加FI处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,利用IF检测F-actin的表达情况;利用qPCR及WB检测PFKP的表达情况;利用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测上清中乳酸的含量。12.对诱导后的THP-1 shNC及sh FN1细胞,添加F-actin抑制剂（Blebbistatin）处理后,利用IF检测F-actin的表达情况;利用WB检测PFKP的表达情况。13.对添加Blebbistatin处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,利用WB检测PFKP的表达情况;利用qPCR检测PFKP及炎性细胞因子的表达情况;利用ELISA检测上清中乳酸的含量。14.对添加FI处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,再加用溶血磷脂酸（lysophosphatidicacid,LPA）处理,利用WB检测PFKP的表达情况。15.对诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞,添加MG-132处理后,利用WB检测PFKP的表达情况。16.对添加FI处理的人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞,再分别加用MG-132、氯喹（chloroquine,CQ）、雷帕霉素（rapamysin,RAPA）及 Blebbistatin处理后,利用WB检测PFKP及自噬相关信号蛋白的表达情况。17.利用诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞RNA-Seq数据,分析炎性细胞因子的表达情况。18.对诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞,利用WB检测pro-IL-1β的表达情况;利用ELISA检测上清中IL-1β的含量。19.人外周血单核细胞诱导为M2型巨噬细胞,分别添加FI及Blebbistatin处理后,利用WB检测IL-1β的表达情况。20.利用PROMO网站结合THP-1 NC及sh FN1细胞RNA-Seq数据,分析转录因子的表达情况。21.人外周血单核细胞诱导为M2型巨噬细胞,分别添加FI及Blebbistatin处理,以及诱导后的THP-1 sh NC及sh FN1细胞,利用WB检测CEBPα的表达情况。22.构建C57BL/6J小鼠构建LLC-luciferase皮下荷瘤模型,利用生物发光成像（bioluminescent imaging,BLI）监测肿瘤生长情况,并利用FCM检测肿瘤内巨噬细胞表型及炎性细胞因子的表达情况,以及肿瘤、脾脏、淋巴结内T细胞功能;利用免疫荧光检测肿瘤内巨噬细胞PFKP及p62表达。结果1.GEO数据分析结果显示FN1在M2型巨噬细胞中高表达。2.单细胞测序数据分析、NSCLC肿瘤组织及体外诱导巨噬细胞检测结果,均验证Fibronectin在TAMs中高表达。3.抑制Fibronectin可使M2型巨噬细胞向M1型极化,分泌炎性细胞因子增多。4.Fibronectin可促进F-actin在M2型巨噬细胞膜内侧聚集,从而促进自噬降解PFKP,降低糖酵解。5.Fibronectin及F-actin通过CEBPα抑制炎性细胞因子IL-1β表达,维持免疫抑制功能。6.在小鼠肺癌模型,阻断Fibronectin信号通路,能够促进TAMs向M1型极化,产生更多炎性细胞因子,增强CD8+ T细胞杀伤功能,抑制LLC肿瘤生长。7.阻断Fibronectin信号通路,在小鼠体内降低TAMs自噬,促进糖酵解。结论Fibronectin在NSCLC癌组织中M2型巨噬细胞高表达,并通过促进F-actin聚集在细胞膜内侧,使PFKP被自噬降解,导致巨噬细胞糖酵解水平降低,同时促进CEBPα表达,抑制炎性细胞因子IL-1β产生,维持巨噬细胞免疫抑制功能。阻断Fibronectin信号通路可降低TAMs自噬、使PFKP表达升高,向促炎型巨噬细胞极化,并增强T细胞杀伤功能,抑制LLC肿瘤生长。