奶牛乳腺炎是由多种病原菌引起的,危害奶牛养殖业最严重的疾病之一,降低了奶制品的质量,给奶牛业造成巨大的经济损失。金黄色葡萄球菌是其主要病原菌之一,该细菌常在奶牛乳房通过形成生物被膜(biofilm)形成慢性感染。抗生素是控制金葡菌感染的主要手段,但是长期不规范的使用抗生素使金葡菌的耐药情况日益严重,尤其是耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-Resistant Staphylococcusaureus,MRSA)的出现,使得金葡菌的防治面临巨大挑战。此外,金葡菌通常具备很强的生物被膜形成能力,其生物被膜可使其对抗菌药物的耐药性增强,且呈现出多重耐药性。胞外多糖黏附因子(PIA)是金葡菌生物被膜的主要组成部分,其形成由ica操纵子编码的蛋白负责,ica操纵子编码icaADBC四个功能基因和一个icaR调节基因,icaR能抑制icaADBC的表达来减少PIA的合成,使生物被膜的形成能力减弱。MRSA菌株的产生使得抗生素治疗面临挑战,而天然、价低、副作用小的中药组分或可以用于奶牛乳腺炎致病菌防治的研究中,中药组分抑制金葡菌生物被膜形成的研究也有少许报道,但较缺乏对于中药抑制金葡菌生物被膜形成机制的研究。本研究探寻了中药地榆与玉米须的提取液对奶牛乳腺炎临床分离MRSA菌株SA3的生物被膜形成及其对SA3成膜基因icaADBC和icaR的影响,并进一步探求了在游离培养及生物被膜培养条件下玉米须水提液对MRSA菌株万古霉素敏感性的影响效应,初步探索了两者联合用药的可能性及条件。本课题主要研究结果共分为以下几部分:1.本研究采用倍比稀释法检测中药提取液和万古霉素对MRSA菌株SA3的最小抑菌浓度(MIC),结果发现,地榆醇提液对SA3的MIC为12.5 mg/mL,而高浓度的玉米须水提液对菌株SA3的生长没有抑制作用,万古霉素对SA3的MIC为 1 μg/mL。2.本研究通过比浊法和菌落计数法检测两种中药提取液对MRSA菌株SA3生长的影响,结果发现,高浓度的地榆醇提液抑制了 SA3的生长;而高浓度的玉米须水提液对SA3的生长没有影响。3.本研究利用96孔细胞培养板检测了不同浓度的中药提取液对菌株SA3生物被膜形成的影响,结果表明,在最佳成膜时间16 h的培养条件下,添加较低浓度的地榆醇提液和玉米须水提液对SA3生物被膜的形成即可产生明显抑制效应,得出地榆醇提液抑制SA3生物被膜形成的最低浓度为2.5 mg/mL;玉米须水提液抑制SA3生物被膜形成的最低浓度为1mg/mL。4.本研究采用激光共聚焦扫描显微镜对含有绿色荧光蛋白质粒的菌株SA3生物被膜在不同条件下进行监测,结果发现在不加中药提取液时SA3能够形成完整而又致密的生物被膜,而加入2.5 mg/mL的地榆醇提液和1mg/mL玉米须水提液后几乎无法检测到生物被膜的形成。5.本研究利用PCR扩增技术及测序技术克隆并精确测序了 MRSA菌株SA3生物被膜的成膜基因icaADBC及icaR的精确序列。6.本研究利用反转录荧光定量PCR技术检测成膜基因icaADBC和icaR的转录水平,结果显示,在加入浓度为1、3 mg/mL的地榆醇提液和浓度为0.5、1、2 mg/mL的玉米须水提液后,icaA、icaD、icaB、icaC的转录水平均显著降低,且随着浓度的增加,地榆和玉米须对icaADBC的抑制作用更强。而icaR基因的转录水平随着地榆醇提液和玉米须水提液浓度的增加而上升。7.本研究探求了玉米须水提液与万古霉素联合用药情况下,菌株SA3在不同培养条件(游离培养及生物被膜状态培养)下生长状态的变化水平。结果表明,玉米须水提液能够通过抑制生物被膜的形成进而提高细菌在生物被膜培养条件下对万古霉素的敏感性。8.综上所述,本研究证实了尽管需要添加较高浓度才能抑制细菌生长,但是低浓度的地榆和玉米须提取液即可显著抑制细菌的生物被膜形成,进一步研究发现上述重要组分能够通过上调转录因子基因icaR的转录水平进而下调icaADBC操纵子的表达,从而抑制多糖PIA的合成达到抑制生物被膜形成的作用。此外,在生物被膜培养条件下,玉米须水提液能提高MRSA菌株对万古霉素的敏感性,提示该重要组分或可作为万古霉素治疗MRSA的辅助手段,为MRSA菌株引起的奶牛乳腺炎的预防和控制提供新的治疗思路。