【摘 要】
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目的:新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是由于多种围生期原因导致的新生儿脑部缺氧、脑血流减少甚至暂停,而引起的胎儿或新生儿脑损伤。该病是引起新生儿急性死亡和远期神经发育障碍的主要原因之一。HIE的发病机制目前尚未明确,临床采用的相关治疗的方法并未呈现理想的结果,部分患儿会有后遗症,甚至导致儿童残疾。在对HIE发病机制及治疗的体外实验研究中
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目的:新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是由于多种围生期原因导致的新生儿脑部缺氧、脑血流减少甚至暂停,而引起的胎儿或新生儿脑损伤。该病是引起新生儿急性死亡和远期神经发育障碍的主要原因之一。HIE的发病机制目前尚未明确,临床采用的相关治疗的方法并未呈现理想的结果,部分患儿会有后遗症,甚至导致儿童残疾。在对HIE发病机制及治疗的体外实验研究中,神经元的氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）模型能够模拟体内缺氧缺血情况,得到广泛应用。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长度为19～24核苷酸（nucleotide,nt）的内源性非编码单链小分子RNA,在神经系统中表达丰富,与神经细胞的发育、分化和生理功能密切相关[1]。缺氧缺血等原因损伤神经元后,miRNA的表达可发生变化,从而影响其相应靶基因的表达,即可通过各种途径影响细胞的凋亡,所以miRNA为神经元凋亡的调控分子,在新生儿HIE中发挥重要的作用。目前miRNA在肿瘤疾病领域的研究比较集中,在神经退行性疾病如阿尔兹海默症中也有较多miRNA对神经元调控作用的相关实验研究。但在HIE领域中,miRNA对神经元凋亡调控的研究有限。本研究选择神经系统内表达丰富的微小RNA132（microRNA-132,miR-132）和氧糖剥夺的神经元进行实验分析,以期探讨在HIE中miR-132对缺氧缺血后神经元凋亡的调控作用。方法:1.培养胎鼠原代海马神经元,制作神经元氧糖剥夺模型,显微镜下观测细胞的形态变化;检测miR-132在此模型中的表达变化。2.通过慢病毒转染技术,分别过表达和下调神经细胞内miR-132基因的表达水平,在此基础上将神经元氧糖剥夺处理,TUNEL检测比较细胞凋亡的变化。3.双荧光素酶报告基因检测miR-132与FOXO3a及Gria2的相互作用;RT-qPCR检测转染慢病毒并氧糖剥夺处理后FOXO3a及Gria2 mRNA表达水平的变化,通过western blot检测转染慢病毒并氧糖剥夺处理后FOXO3a及Gria2蛋白表达水平变化。结果:1.神经元出现凋亡形态学改变,核固缩、细胞皱缩,部分神经元甚至出现核碎裂及核溶解、胞体崩裂,成功制作神经元OGD模型;RT-qPCR检测miR-132的表达下调,P＜0.05,随着OGD时间延长,miR-132的表达下调更明显,P＜0.01,结果具有统计学差异性。2.被转染的神经元带有绿色荧光,转染率＞85%,转染成功;转染并氧糖剥夺处理神经元后,TUNEL法检测细胞凋亡变化,下调miR-132转染组与阴性对照组比较,细胞凋亡程度严重,P＜0.01;上调miR-132转染组与阴性对照组比较,细胞凋亡程度减轻,P＜0.05,结果均具有统计学差异性。3.双荧光素酶报告基因检测,miR-132 mimics与FOXO3a的野生型相结合比与突变型相结合荧光表达降低,P＜0.05,双荧光素酶报告基因检测miR-132 mimics与Gria2的野生型相结合比与突变型相结合荧光表达降低,P＜0.05,结果具有统计学差异性;RT-qPCR检测mRNA表达变化,下调miR-132转染组较阴性对照组FOXO3a表达增高,P＜0.01,上调miR-132转染组较阴性对照组FOXO3a表达减低,P＜0.05,结果具有统计学差异性;下调miR-132转染组较阴性对照组Gria2表达减低,P＜0.05,结果具有统计学差异性,上调miR-132转染组较阴性对照组Gria2表达无明显变化。Western blot检测两个靶蛋白表达变化,下调miR-132转染组较阴性对照组FOXO3a表达增高,P＜0.01,结果具有统计学差异性,上调miR-132转染组较阴性对照组FOXO3a表达无明显变化;下调miR-132转染组较阴性对照组Gria2表达减低,P＜0.05,结果具有统计学差异性,上调miR-132转染组较阴性对照组Gria2表达无明显变化。结论:1.OGD后海马神经元miR-132的表达量下降,随着氧糖剥夺时间延长,miR-132的表达量下降更加明显。2.miR-132的表达量下调可加重氧糖剥夺海马神经元的凋亡,miR-132的表达量上调可减轻氧糖剥夺海马神经元的凋亡。miR-132可作为神经元氧糖缺乏时的一种保护性因子,对神经元的凋亡起到抑制作用。3.miR-132的表达量变化可影响其靶基因FOXO3及Gria2的表达。miR-132调节氧糖剥夺神经元凋亡的途径可能是通过对靶基因FOXO3及GluR2的调节来实现的。
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