母胎液体交换及羊水循环对于正常妊娠胎儿的活动、生长和发育至关重要;母胎液体平衡紊乱及羊水循环紊乱与不良的围生结局密切相关,然而其发病的分子机制尚不清楚,目前也没有有效的预防及治疗措施。因此,探索母胎液体交换及羊水平衡紊乱的机理、寻找治疗母胎液体平衡紊乱的作用靶点及药物治疗靶点将有助于降低围产儿发病率及死亡率,减少新生儿的出生缺陷,提高围产医学质量。水通道蛋白一族广泛存在于上皮和内皮细胞膜上的小分子(28-30KD)糖蛋白,因其介导自由水快速被动的跨生物膜转运故名“水通道”。目前在哺乳动物细胞膜上已发现了13种水通道蛋白(AQP0-12)。近20年的研究结果显示:AQP1广泛分布泌尿、呼吸、消化、神经、生殖等系统,参与机体的与水代谢相关的多个脏器的生理和病理过程。本课题组的前期工作系统描述了AQP1在人胎盘与胎膜组织中的表达与分布,首次研究临床羊水量异常病例胎盘与胎膜组织中AQPs表达的变化,发现羊水过少临床病例胎盘组织和胎膜组织AQP1 mRNA表达显著低于正常晚期妊娠胎盘组织和胎膜,这些结果提示AQP1在母-胎液体交换过程中可能发挥重要作用。基因敲除技术的发展为研究基因的功能和表达调控及人类多种疾病的分子机制开辟了新途径。AQP1基因敲除鼠的建立为AQP1在多个脏器及组织(肾脏、肺、脑、眼等)的水转运中发挥作用提供了直接证据,但是AQP1基因敲除鼠妊娠相关表型的变化罕见报道。本研究拟应用AQP1基因敲除小鼠模型对其妊娠期羊水量、胎儿情况及胎盘情况进行动态物理及分子检测,探寻AQP1缺失后母胎液体平衡的变化,以提供AQPs在母-胎液体交换发挥作用的直接证据,寻找可能应用于临床的药物靶点和治疗靶点。第一章AQP1在小鼠胎盘、胎膜组织的表达【研究目的】研究水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)在小鼠胎盘、胎膜组织的分布及表达,初步探讨AQP1在母胎液体平衡及羊水循环中的作用。【材料与方法】取四只孕13天成年健康CD-1纯系野生型小鼠胎盘、胎膜组织(每只孕鼠分别选取一例),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术及免疫组织化学技术检测AQP1胎盘及胎膜组织中的表达,确定AQP1表达部位及范围。【结果】1. RT-PCR技术证实AQP1在CD-1野生型孕鼠胎盘、胎膜组织表达;2.免疫组织化学方法发现AQP1表达于小鼠羊膜上皮细胞、胎盘血管内皮细胞和滋养细胞;【结论】CD-1纯系野生型孕鼠胎盘、胎膜组织均有AQP1在mRNA和蛋白水平的表达,提示AQP1可能在母胎液体平衡中发挥作用。第二章小鼠AQP1缺失后妊娠相关表型的变化【研究目的】研究AQP1基因缺失后胎儿及附属物的变化,从而寻找AQP1在母胎液体平衡中发挥作用的直接证据。【材料与方法】将纯合子AQP1基因敲除小鼠(AQP1-KO mice)按雌雄2﹕1的比例合笼交配,第二日检出阴道栓者记为妊娠第1天(1 days postcoitum, 1dpc)。根据孕龄将AQP1基因敲除孕鼠分组;相同条件下对CD-1纯系野生小鼠合笼交配及分组。1.将两组按孕龄(孕7天、13天、16天、18天和足月分娩)分为五个小组,动态记录孕鼠胚胎数、肉眼可见的萎缩胚胎数及新生鼠仔数;2.按孕龄(孕13天、16天、18天)记录胎鼠重量,胎盘湿重,胎盘面积及羊水量;另取孕16天的羊水样本测量离子成分及渗透压;3.取两组孕13天的胎盘组织,采用HE染色观察AQP1缺失后小鼠胎盘组织的变化;4.统计学方法:单因素方差分析及卡方检验用来做统计学检测。【结果】1.与同孕龄野生鼠相比,AQP1基因敲除鼠的孕囊数目随着妊娠天数的延长而进行性下降;肉眼可见的萎缩胚胎数在妊娠18天时显著高于野生鼠(P=0.027);2. AQP1基因敲除鼠胎鼠在妊娠16天、18天及新生鼠的体重明显低于同龄野生鼠(P=0.000;0.000;0.000);3. AQP1基因敲除鼠的羊水量在妊娠的13、16、18天明显高于野生鼠(P=0.011;0.000;0.000);且妊娠16天羊水中尿素、肌酐水平下降,表现为低渗状态(P=0.000);4.孕13天AQP1基因敲除鼠胎盘组织质量明显大于同孕龄野生鼠,而孕18天却明显低于同孕龄野生鼠;5.胎盘HE染色:CD-1纯系野生鼠胎盘HE染色可见正常小鼠胎盘三层结构:大滋养细胞层,可见多倍体巨细胞;海绵样滋养层,其组织疏松、均匀,内见多倍体滋养细胞及二倍体滋养细胞;迷路样滋养层,血管网与滋养细胞交互缠绕形成迷路样结构,其内血运丰富;而AQP1基因敲除鼠胎盘大滋养细胞层显示不清;海绵样滋养层少见大滋养细胞,层内网眼间隙变窄或消失,血管腔变形管壁僵硬;迷路样结构显示不清,其内血运欠丰。【结论】1、AQP1基因敲除鼠妊娠相关表型发生改变;2、AQP1缺失可导致胚胎丢失数目增多,胎鼠生长受限,羊水量增加及胎盘结构的改变;3、本研究为AQP1在胚胎生长发育和母胎液体平衡中发挥作用提供了直接证据。