矽肺(Silicosis)是由于长期吸入含游离大量二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)的工业性粉尘所引起的职业性疾病,以矽结节的形成和弥漫性肺间质性纤维化为主要病理特点。矽肺纤维化发生机制复杂,脱离粉尘环境后肺纤维化仍继续进展,目前尚无有效的治疗手段,且缺乏敏感有效的诊断指标,这些问题给矽肺纤维化的防治工作带来了极大的困难与挑战。因此,深入探讨矽肺纤维化的发生、发展机制及寻找有效的防治靶点一直是职业病研究领域中的重点、难点任务。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为18-24个核苷酸的非编码单链RNA分子,参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等多种生理、病理过程,其是多种疾病的重要发病机制,也可作为某些疾病潜在的标记物。在本研究中,建立了吸入性矽肺大鼠模型,首先采用高通量测序技术筛选肺组织内差异表达的miRNAs,并进行相应的生物信息学分析;其次,对差异变化最为明显的miRNAs在体内外进行验证,并分析其对Ⅰ型胶原(collage type Ⅰ,Col Ⅰ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的调节作用,即调节胶原沉积和肌成纤维细胞分化的关系;最后,以miR-411-3p作为研究靶点,观察其通过对下游靶基因,包括心肌相关转录因子(myocardin related transcription factor,MRTF)-A 和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1/Smurf2信号的调节,从而参与调控矽肺纤维化的发生、发展过程。研究共分为四部分:第一部分 矽肺纤维化大鼠肺组织中差异miRNAs的筛选、验证及生物信息学分析目的:通过高通量信息测序技术,筛选实验性矽肺大鼠肺组织miRNA的差异表达谱及对差异miRNA进行生物信息学分析。方法:1.采用动式染尘法构建大鼠矽肺纤维化模型,wistar大鼠随机2组:1)对照24周组:吸入纯净气(无SiO2);2)染尘24周组:吸入50μg/m3的 SiO2。2.采用HE染色、VG染色及免疫印迹(western blot)实验观察大鼠矽肺模型肺组织的病理形态、胶原沉积情况及α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达。3.采用高通量信息测序技术筛选矽肺大鼠肺组织中差异表达的miRNAs。4.对差异表达的miRNAs进行靶基因预测、GO及KEGG分析。5.采用实时荧光定量 PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)法验证部分差异miRNAs在矽肺大鼠肺组织中的表达情况。结果:1.HE染色结果显示,与对照24周组相比,在染尘24周组出现典型的矽结节,其数量和面积百分比显著高于对照24周组(P<0.05);VG染色结果显示,染尘24周组矽结节内可见大量胶原沉积,胶原含量显著高于对照24周组(P<0.05);免疫印迹结果显示,与对照24周组相比较,α-SMA和ColⅠ表达在染尘24周组显著上调(P<0.05),提示矽肺模型构建成功。2.高通量测序结果显示,与对照24周组相比较,染尘24周组中有70个差异表达的miRNAs,其中41个表达上调,29个表达下调(P<0.05)。KEGG分析结果显示,上调的miRNAs主要与癌症、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路有关,下调的miRNAs主要与MAPK信号通路、肿瘤蛋白聚糖信号、cGMP-PKG信号通路有关。3.RT-qPCR法结果显示,与对照24周组相比较,miR-292-5p、miR-292-3p、miR-295-3p、miR-291a-3p、miR-155-3p在染尘 24 周组中表达上调,而 miR-411-3p、miR-370-3p、miR-409a-5p、miR-433-3p、miR-1193-3p在染尘24周组中表达下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。第二部分 差异miRNAs对TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞α-SMA和ColⅠ蛋白表达的调节作用目的:研究差异表达miRNAs对基础水平及TGF-β1诱导的大鼠原代肺成纤维细胞α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达的影响。方法:1.原代培养大鼠新生鼠肺成纤维细胞,分别转染miRNAs的模拟物(mimic)及抑制剂(inhibitor),分别在基础水平和TGF-β1诱导水平下进行检测,实验分组为:1)对照组;2)TGF-β1组;3)转染荧光对照组;4)mimic-NC组;5)mimic 组;6)inhibitor-NC 组;7)inhibitor 组;8)mimic-NC+TGF-β1组;9)mimic+TGF-β1 组;10)inhibitor-NC+TGF-β1 组;11)inhibitor+TGF-β1 组。2.采用RT-qPCR法检测miRNA表达水平。3.Western blot 法检测 α-SMA 和 Col Ⅰ 的表达。结果:1.RT-qPCR检测结果显示,与对照组相比较,TGF-β1诱导组miR-155-3p 表达上调;而 miR-292-5p、miR-411-3p、miR-370-3p、miR-409a-5p 和 miR-1193-3p 表达下调(P<0.05)。2.与对照 mimic-NC 组相比,miR-292-5p、miR-291a-3p 和miR-155-3p 的 mimic 组 α-SMA 蛋白表达上调(P<0.05);miR-1193-3p、miR-411-3p、miR-409a-5p 和 miR-433-3p 的 mimic 组 α-SMA 蛋白表达下调(P<0.05);与 inhibitor-NC 组相比,miR-292-3p、miR-291a-3p 和miR-295-3p 的 inhibitor 组 α-SMA 蛋白表达下调(P<0.05);miR-1193-3P、miR-411-3p、miR-409a-5p 和 miR-433-3p 的 inhibitor 组 α-SMA 蛋白表达上调(P<0.05)。与对照 mimic-NC 组相比,miR-292-5p、miR-155-3p 和 miR-295-3p的 mimic 组 Col Ⅰ 蛋白表达上调(P<0.05);miR-411-3p 和 miR-370-3p 的mimic组ColⅠ蛋白表达下调(P<0.05);与对照inhibitor-NC组相比,在miR-292-5p、miR-155-3p 和 miR-295-3p 的 inhibitor 组 Col Ⅰ 蛋白表达下调(P<0.05);miR-41 1-3p 的 inhibitor 组 Col Ⅰ 蛋白表达上调(P<0.05)。3.与对照组相比较,TGF-β1诱导组α-SMA和ColⅠ蛋白水平显著升高(P<0.05)。4.与 mimic-NC+TGF-β1 组比较,miR-292-5p、miR-292-3p、miR-291a-3p 和 miR-295-3p 的 mimic+TGF-β1 组中 α-SMA 蛋白表达上调(P<0.05);miR-411-3p、miR-370-3p、miR-433-3p 和 miR-1193-3p 的mimic+TGF-β1 组中 α-SMA 蛋白表达下调(P<0.05);与 inhibitor-NC+TGF-β1 组比较,在miR-292-5p 和 miR-292-3p 的 inhibitor+TGF-β1 组中α-SMA蛋白表达下调(P<0.05);miR-411-3p、miR-370-3p和miR-1193-3p的inhibitor+TGF-β1组中α-SMA蛋白的表达上调(P<0.05)。与 mimic-NC+TGF-β1 组比较,在miR-292-5p、miR-292-3p、miR-291a-3p 和 miR-155-3p 的 mimic+TGF-β1 组中 Col Ⅰ 蛋白表达上调(P<0.05);miR-411-3p、miR-370-3p、miR-409a-5p 和 miR-1193-3p 的mimic+TGF-β1 组中 ColⅠ 蛋白表达下调(P<0.05);与 inhibitor-NC+TGF-β1 组比较,在miR-292-5p 和 miR-291a-3p 的 inhibitor+TGF-β1 组中Col Ⅰ蛋白表达下调(P<0.05);miR-411-3p、miR-370-3p和miR-1193-3p的inhibitor+TGF-β1组中ColⅠ蛋白表达上调(P<0.05)。第三部分 miR-411-3p通过靶向调节MRTF-A/SRF信号发挥抑制矽肺纤维化的作用目的:研究miR-411-3p通过调控MRTF-A/SRF信号参与调节矽肺纤维化的作用及其机制。方法:1.原代培养肺成纤维细胞,实验分组为:1)对照组;2)TGF-β1组;3)mimic-NC 组;4)miR-411-3p mimic 组;5)inhibitor-NC 组;6)miR-411-3p inhibitor 组;7)mimic-NC+TGF-β1 组;8)miR-411-3p mimic+TGF-β1组;9)inhibitor-NC+TGF-β1 组;10)miR-411-3p inhibitor+TGF-β1 组。2.原代培养成纤维细胞,实验分组:1)siRNA-NC组;2)si-MRTF-A组;3)siRNA-NC+TGF-β1 组;4)si-MRTF-A+TGF-β1 组。3.采用支气管灌注构建矽肺小鼠模型,实验分组为:1)对照组;2)Silica 组;3)Silica+agomir NC 组;4)Silica+agomir miR-411-3p 组。4.采用HE染色、天狼星红染色观察小鼠矽肺模型肺组织的病理形态及胶原沉积情况。5.采用FinePointe WBP全身体积扫描系统检测小鼠肺功能。6.采用原位杂交法检测miR-411-3p的原位表达。7.采用CCK-8法检测细胞活性,划痕实验检测细胞迁移能力。8.免疫荧光法检测MRTF-A和α-SMA在矽肺大鼠肺组织中的共定位表达。9.采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-411-3p与Mrtfα的结合。10.Western blot 及 RT-qPCR 法检测 MRTF-A、SRF、α-SMA 和 Col Ⅰ蛋白及mRNA表达水平。结果:1.原位杂交实验结果显示,在对照24w组中红色荧光标记的miR-411-3p定位表达于正常的肺泡上皮和支气管上皮,而与对照24w组相比较,染尘24w组矽结节中miR-411-3p表达明显下调;同时在煤工尘肺的肺组织中miR-411-3p表达也明显减弱;在大鼠肺成纤维细胞中,与对照组相比较,TGF-β1诱导组miR-411-3p表达显著下调,且miR-411-3p定位表达于大鼠肺成纤维细胞的胞浆中。2.CCK-8检测结果显示,与转染对照miR-411-3p m-NC组比较,miR-411-3p mimic组大鼠肺成纤维细胞活性显著抑制;而与转染对照miR-411-3p i-NC组相比较,miR-411-3p inhibitor组大鼠肺成纤维细胞活性显著提高(P<0.05)。与空白对照组相比较,TGF-β1诱导组大鼠肺成纤维细胞活性显著上调(P<0.05)。与对照miR-411-3p m-NC+TGF-β1组相比,大鼠肺成纤维细胞活性在miR-411-3p mimic+TGF-β1诱导组显著下调,与对照miR-411-3p i-NC+TGF-β1组相比,大鼠肺成纤维细胞活性在 miR-411-3p inhibitor+TGF-β1 诱导组显著上调(P<0.05)。3.划痕实验显示,与空白对照组(Control)相比,TGF-β1诱导组肺成纤维细胞迁移率明显上调;与转染对照miR-411-3p m-NC+TGF-β1组相比,miR-411-3p mimic+TGF-β1组肺成纤维细胞迁移率明显下调;与对照miR-411-3p i-NC+TGF-β1 组相比,miR-411-3p inhibitor+TGF-β1 组肺成纤维细胞迁移率明显上调(P<0.05)。4.Western blot法检测结果显示,与对照24周组相比,染尘24周组MRTF-A和SRF蛋白表达水平显著上调;与对照组相比较,TGF-β1诱导组MRTF-A和SRF蛋白表达水平也显著上调(P<0.05)。5.免疫组织荧光法检测结果表明,与对照24周组相比,染尘24周组MRTF-A(绿色荧光)与α-SMA(红色荧光)共表达于矽结节区域。6.Western blot法检测结果显示,与SiRNA-NC组比较,Si-MRTF-A组MRTF-A、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表达均明显下调;与SiRNA-NC+TGF-β1组相比,Si-MRTF-A+TGF-β1组MRTF-A、α-SMA和ColⅠ蛋白表达也显著下调(P<0.05)。7.RT-qPCR 法检测结果显示,与 mimic-NC 组比较,miR-411-3P mimic组 miR-411-3P 水平显著增高,而 MRTF-A、SRF、α-SMA 和 Col Ⅰ 的 mRNA的表达量显著下调(P<0.05);与 inhibitor-NC 组相比,miR-411-3P inhibitor组MRTF-A、SRF、α-SMA和ColⅠ的mRNA的表达量变化并不显著(P>0.05)。Western blot 检测结果显示,与 mimic-NC 组比较,miR-411-3P mimic组MRTF-A和SRF蛋白表达明显下调,而与inhibitor-NC组相比,miR-411-3P inhibitor组的SRF蛋白表达显著上调(P<0.05)。8.RT-qPCR法检测结果显示,与mimic-NC+TGF-β1组比较,miR-411-3p mimic+TGF-β1 组 MRTF-A、α-SMA 和 Col Ⅰ 的 mRNA 的表达下调;与 inhibitor-NC+TGF-β1 组相比,miR-411-3p inhibitor+TGF-β1 组MRTF-A、α-SMA 和 ColⅠ 的 mRNA 的表达上调(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与 mimic-NC+TGF-β1 组比较,miR-411-3p mimic+TGF-β1组MRTF-A蛋白表达显著下调,而与inhibitor-NC+TGF-β1组相比,miR-411-3p inhibitor+TGF-β1 组 MRTF-A 蛋白表达显著上调(P<0.05)。9.双荧光素酶报告基因实验结果显示,与Mrtfa 3’UTR Mut+miR-NC组比较,Mrtfa 3’UTR Mut+miR-411-3p mimic组双荧光素酶活性没有明显变化(P>0.05),而与 Mrtfa 3’UTR Wt+miR-NC 组比较,Mrtfa 3’UTR Wt+miR-411-3p mimic组中双荧光素酶活性显著下调(P<0.05)。10.小鼠肺组织HE染色结果显示,与对照组比较,矽肺组出现明显矽结节,其数量和面积百分比显著高于对照组;而与Silica+agomir-NC组比较,Silica+agomir miR-411-3p组矽结节的数量和面积百分比显著降低(P<0.05)。天狼星红染色结果显示,与对照组比较,矽肺组出现明显胶原沉积;而与 Silica+agomir-NC 组比较,Silica+agomirmiR-411-3p 组胶原沉积量明显减少(P<0.05)。11.组织原位杂交实验结果显示,与对照组比较,矽肺组miR-411-3p(红色荧光标记)表达显著下调,而与Silica+agomir-NC组比较,Silica+agomirmiR-411-3p 组 miR-411-3p 水平明显增高。12.FinePointe WBP全身体积扫描系统检测小鼠肺功能结果显示,与对照组比较,矽肺组呼气峰值时间比率(Rpef)明显下调,而吸气末端暂停(EEP)值、呼吸暂停(PAU)和气道狭窄指数(Penh)显著上调,与Silica+agomir-NC 组比较,Silica+agomir miR-411-3p 组 Rpef 显著上调,而EEP、PAU和Penh明显下调(P<0.05)。13.免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较,矽肺组α-SMA表达显著上调,而与 Silica+agomir-NC 组比较,Silica+agomirmiR-411-3p 组α-SMA表达显著下调(P<0.05)。14.RT-qPCR结果显示,与对照组比较,矽肺组miR-411-3p表达量显著下调,而MRTF-A、SRF、α-SMA和ColⅠ的mRNA水平显著上调;与 Silica+agomir-NC 组比较,Silica+agomir miR-411-3p 组 miR-411-3p 水平明显上调,而MRTF-A、α-SMA和Col Ⅰ的mRNA的表达显著下调(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,矽肺组MRTF-A、SRF、α-SMA和Col Ⅰ的蛋白表达显著上调,与Silica+agomir-NC组比较,Silica+agomir miR-411-3p 组 MRTF-A、SRF、α-SMA 和 ColⅠ 蛋白表达显著下调(P<0.05)。第四部分 miR-411-3p通过靶向调节Smurf2/TGF-β信号发挥抑制矽肺纤维化的作用目的:研究miR-411-3p通过调控Smurf2/TGF-β信号参与调节矽肺纤维化的作用及其机制。方法:1.采用动式染尘构建的大鼠矽肺纤维化模型,实验分组为:1)对照24周组:吸入纯净气(无SiO2);2)染尘24周组:吸入50 μg/m3的SiO2。2.原代培养肺成纤维细胞,实验分组为:1)对照组;2)TGF-β1组;3)TGF-β1+LY364947 组;4)mimic-NC+TGF-β1 组;5)miR-411-3p mimic+TGF-β1 组;6)inhibitor-NC+TGF-β1 组;7)miR-411-3p inhibitor+TGF-β1组。3.原代培养肺成纤维细胞,实验分组为:1)siRNA-Nc组;2)si-Smurf2组;3)siRNA-Nc+TGF-β1 组;4)si-Smurf2+TGF-β1 组。4.采用支气管灌注构建矽肺小鼠模型,实验分组为:1)对照组;2)Silica 组;3)Silica+agomir NC 组;4)Silica+agomir miR-411-3p。5.采用免疫组化染色法检测Smurf2、TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-β1和Smad7的定位表达。6.采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-411-3p与Smurf2的结合。7.采用 RT-qPCR 及 Western blot 法检测 Smurfl、Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2、Smad7 及 p-Smad2/3 的 mRNA、蛋白的表达。结果:1.免疫组织化学染色法检测显示,与对照24周组相比较,Smurf2明显高表达于染尘24周组的矽结节中(P<0.05)。2.在大鼠肺组织中,RT-qPCR检测结果显示,与对照24周组相比较,染尘24周组Smurf2、TGF-β1及TGF-βR1的mRNA显著高表达,Smad7的mRNA明显下调(P<0.05),而Smurfl的mRNA在染尘24周组大鼠肺组织中表达变化不显著(P>0.05)。Western blot法检测结果显示,与对照24周组相比较,染尘24周组Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2及p-Smad2/3蛋白表达显著上调,而Smad7蛋白表达显著下调(P<0.05)。3.在大鼠肺成纤维细胞中,RT-qPCR检测结果显示,与对照组相比较,TGF-β1诱导组Smurf2和TGF-βR1的mRNA表达水平明显上调,而Smad7的mRNA表达水平明显下调(P<0.05)。Western bolt法检测结果显示,与对照组相比较,TGF-β1诱导组Smurf2、TGF-βR1、TGF-βR2及p-Smad2/3蛋白表达明显上调,而Smad7蛋白表达明显下调(P<0.05)。4.在大鼠肺成纤维细胞中,Western bolt法检测结果显示,与TGF-β1组相比较,TGF-β1+TGF-βR1 抑制剂(LY364947)组 TGF-βR1、Smurf2及p-Smad2/3的蛋白表达显著下调,而Smad7蛋白表达显著上调(P<0.05)。5.在大鼠肺成纤维细胞中,Western bolt及RT-qPCR检测结果显示,与转染对照组(siRNA-NC)相比较,si-Smurf2 1#、2#和3#序列组Smurf2表达均显著下调,其中si-Smurf2 2#序列组Smurf2下调最显著(P<0.05)。6.在大鼠肺成纤维细胞中,RT-qPCR检测结果显示,与siRNA-NC相比较,si-Smurf2 组 Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1 及 α-SMA 的 mRNA 表达显著下调,而Smad7 mRNA表达显著上调(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与siRNA-NC相比较,si-Smurf2组Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1及TGF-βR2蛋白表达显著降低,Smad7蛋白表达显著增高(P<0.05)。7.在TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞中,RT-qPCR检测结果显示,与 siRNA-NC+TGF-β1 组相比较,si-Smurf2+TGF-β1 组 Smurf2及 TGF-β1、TGF-βR1、α-SMA、Col Ⅰ 的 mRNA 表达显著下调,而 Smad7 mRNA 表达显著上调(P<0.05)。Western blot法检测结果显示,与siRNA-NC+TGF-β1 组相比较,si-Smurf2+TGF-β1 组 Smurf2及 TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2、p-Smad2/β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表达显著降低,而Smad7蛋白表达显著增高(P<0.05)。8.双荧光素酶报告基因显示,与Smurf2 3’UTRMut+miR-NC组比较,Smurf2 3’UTRMut+miR-411-3p mimic组双荧光素酶活性没有明显变化(P>0.05),而与Smurf2 3’UTR Wt+miR-NC 组比较,Smurf2 3’UTR Wt+miR-411-3p mimic组中双荧光素酶活性显著下调(P<0.05)。9.在TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞中,RT-qPCR检测结果显示,与mimic的转染对照组(m-NC+TGF-β1)比较,miR-411-3p的模拟物(mimic)+TGF-β1 组 Smurf2、TGF-β1 及 TGF-βR1 的 mRNA 表达水平明显下调,而Smad7的mRNA表达水平明显上调;与inhibitor的转染对照组(i-NC+TGF-β1)比较,miR-411-3p 的抑制剂(inhibitor)+TGF-β1组Smurf2、TGF-β1及TGF-βR1的mRNA表达水平明显上调,而Smad7的mRNA表达水平明显下调(P<0.05)。Western blot的结果显示,与m-NC+TGF-β1 组比较,miR-411-3p mimic+TGF-β1 组 Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2及Smad2/3的蛋白表达水平明显下调,而Smad7的蛋白表达水平明显上调;与i-NC+TGF-β1组比较,miR-411-3p inhibitor+TGF-β1 组 Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2 及 p-Smad2/3 的蛋白表达显著上调,而Smad7的蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。10.在小鼠肺组织内,RT-qPCR检测结果显示,与对照组比较,矽肺组Smurf2、TGF-β1及TGF-βR1的mRNA表达显著上调,而Smad7在矽肺组表达显著下调;与 Silica+agomir-NC 组相比,Silica+agomir miR-41 1-3p组Smurf2、TGF-β1及TGF-βR1的mRNA表达显著下调,而Smad7的mRNA表达显著上调(P<0.05)。11.免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较,矽肺组Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1及TGF-βR2高表达于矽结节中,而Smad7在矽结节中表达降低;与 Silica+agomir-NC 组相比,Silica+agomir miR-41 1-3p 组Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1 及 TGF-βR2 表达显著下调,而 Smad7 的表达显著上调。12.在小鼠肺组织内,Western blot检测结果显示,与对照组比较,矽肺组 Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2 及 p-Smad2/3 蛋白表达水平明显上调,而Smad7蛋白表达在矽肺组显著下调;与Silica+agomir-NC组相比,Silica+agomir miR-411-3p 组 Smurf2、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2及p-Smad2/3蛋白表达水平下调,而Smad7蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论1.通过高通量测序技术在动式染尘法构建的大鼠矽肺纤维化模型中筛选出70个差异表达的miRNAs,其中部分差异miRNAs调节肺成纤维细胞胶原沉积与肌成纤维细胞转化。2.miR-411-3p通过调节靶基因Mrtfa和Smurf2发挥抑制矽肺纤维化的作用。