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背景:发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是新型布尼亚病毒(Novel BunyavirusNBV,也称为SFTSV)感染所致的,主要在中国传播的新发急性危重传染病,以宿主免疫功能失调、细胞因子风暴导致 ·的多脏器功能障碍综合征(MODS)为特点,死亡率可高达30%。至今,SFTSV感染及其致病机制尚未阐明。在当前SFTSV感染缺乏有效治疗措施的情况下,进一步研究阐释SFTSV感染及导致疾病重症化的机制显得尤为重要、紧迫。作为重要的天然免疫细胞,树突状细胞(Dendritic cells,DCs)和单核细胞有可能在SFTS致病机制中发挥重要作用。目的:本研究通过动态检测SFTS患者外周血树突状细胞、CD14+单核细胞频数、表型及功能变化,从而探讨树突状细胞及其前体细胞CD14+单核细胞在SFTS发病机制中的作用,并分析其与SFTS重症化的相关性。方法:1.动态收集115例(包括21例死亡患者)SFTS患者,同时纳入25例健康病例作为对照,抽取入选研究对象的抗凝全血,通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs);并记录患者临床及实验室检查资料。2.分离后的PBMC一部分用于TRIZOL法提取细胞RNA,实时荧光定量(RT-PCR)检测TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8基因表达;一部分用流式细胞仪检测外周血髓样树突状细胞(Myeloid dendritic cells,mDC)和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC)、CD14+单核细胞分别占PBMC百分比,并分别检测其细胞表型的变化。3.利用Logistic线性回归及受试者工作特征曲线(ROC曲线)诊断试验判断SFTSV病毒载量及树突细胞频率对疾病预后的预测作用及预测效能。4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者急性期及恢复期血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ等细胞因子表达。5.体外用TLR2配体Pam3CSK4(Pam3C)刺激PBMC,流式细胞仪检测CD14+单核细胞内炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ表达变化。6.经免疫磁珠阳性选择的方法分离PBMC中CD14+单核细胞,经细胞因子白介素4(IL-4)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)体外刺激培养,诱导为单核细胞来源的树突状细(Monocyte-derived dendritic cell,MoDC)。Pam3C刺激MoDC 24小时后,用流式细胞仪检测刺Pam3C激前后MoDC的表型(HLA-DR、CD83、CD80、CD86)变化。将Pam3C刺激后的MoDC与来源于同一健康人的CD4+T细胞进行混合淋巴细胞培养(MLR),流式细胞术检测MoDC刺激同种异体T淋巴细胞活化的能力。结果:1.SFTS患者外周血DC细胞亚群、频率、表型变化及与患者预后的相关性分析:1)SFTS患者急性期外周血mDC和pDC细胞频率降低,明显低于健康对照组和恢复期;相比于存活组,死亡组mDC频率明显降低(P=0.0454),而pDC频率无明显差异;2)SFTS患者急性期mDC表面共刺激分子CD80和CD86表达降低,明显低于健康对照组和恢复期,但在存活组与死亡组之间无明显差异;急性期和恢复期pDC表面CD80的表达明显高于健康对照组(P<0.0001,P<0.05),而CD86的表达在三组之间无明显差异;3)SFTS患者急性期血清IL-6、IL-10、TNF-α表达升高,明显高于健康对照组和恢复期,并与SFTS RNA表达呈正相关;4)SFTS患者急性期mDC细胞频率与SFTSRNA、IL-6、IL-10、TNF-α的表达呈负相关;5)SFTS患者mDC细胞频率(特别是发病第9天以后)可以作为疾病的保护性因素(OR,0.487;95%CI,0.432-0.549;P<0.0001)。6)发病第9天后mDC占PBMC百分率(mDC%)的ROC曲线线下面积(AUC)为 0.929(95%CI:0.863-0.996,P<0.0001),此外,当 mDC%≤0.075%时提示患者预后不佳。2.SFTS患者外周血MoDC表型检测及功能分析:1)Pam3C刺激后,SFTS组MoDC表面CD86、CD83的表达明显低于健康对照组(P<0.05,P<0.01);此外,SFTS组MoDCLnc-DCmRNA的表达明显低于健康对照组(P=0.0357)。2)混合淋巴细胞培养后,相比于健康对照组,SFTS组MoDC刺激CD4+T细胞活化的表面标志CD69表达明显降低(P<0.001),CD4+T细胞分泌TNF-a、IFN-Y百分比明显降低(P<0.001,P<0.0001);3.SFTS患者外周血CD14+单核细胞表面TLR2表达及与疾病重症化的相关分析:1)SFTS组TLR2、TLR4 mRNA的表达明显高于健康对照组(P<0.01,P<0.05);2)SFTS患者急性期CD14+单核细胞占PBMC百分比降低,明显低于健康对照组和恢复期(P<0.0001,P<0.0001),死亡组与存活组之间无显著性差异;急性期CD14+单核细胞表面TLR2表达增高,明显高于健康对照组和恢复期(P<0.05,P<0.05),并且死亡组明显高于存活组(p<0.01);3)CD14+单核细胞TLR2表达与SFTSRNA、ALT、AST、CK、LDH和γ-GT呈正相关。4)SFTS患者急性期CD14+单核细胞TNF-α、IFN-γ表达增高,明显高于健康对照组和恢复期(P<0.0001,P<0.0001;P<0.0001,P<0.001);此外,Pam3C 刺激后,SFTS组CD14+单核细胞TNF-α、IFN-γ的表达高于健康对照组(P<0.01,P<0.05),并且CD14+单核细胞TLR2表达与TNF-α表达呈正相关(R=0.6608,P=0.0375)5)SFTS患者急性期血清TNF-α、IFN-γ表达增高,明显高于健康对照组和恢复期(P<0.0001,P<0.0001;P<0.0001,P<0.0001);并且死亡组明显高于存活组(P<0.0001;P<0.0001);6)SFTS患者急性期CD14+单核细胞表面CD86表达降低,明显低于健康对照组(p<0.01),死亡组明显低于存活组(P<0.05)。结论:1.SFTS患者外周血mDC、pDC、CD14+单核细胞频率降低,mDC表面标记降低;mDC频率可作为评价患者预后的一个重要动态指标。2.SFTS患者外周血MoDC表型缺失、成熟障碍、活化T细胞功能下降,可能是SFTS发病的机制之一。3.SFTS患者外周血CD14+单核细胞表面TLR2表达上调,并且可能通过诱导细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌,导致疾病的重症化。