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一、地西他滨治疗儿童R/R-AML和MDS的疗效观察目的:儿童难治/复发急性髓细胞白血病(refractory/relapsed acute myeloid leukemia,R/R-AML)和骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes,MDS)是国际治疗难题,治疗后完全缓解率低,且目前关于儿童髓系肿瘤的靶向治疗研究较少。目前关于地西他滨在儿童R/R-AML和MDS治疗中的报道较少,本研究将评估地西他滨联合低剂量化疗在儿童R/R-AML和MDS治疗中的治疗效果,为R/R-AML和MDS治疗提供参考。方法:回顾性分析以地西他滨联合低剂量化疗作为诱导缓解治疗方案的21例R/R-AML和MDS患儿的临床资料,评估该方案的治疗反应率、治疗相关毒副作用。不良反应分级根据美国国立肿瘤研究所常见毒性标准(Version4.0)进行判定。结果:21例患儿,包括MDS 3例,MDS转化为AML 4例,AML 14例(6例为2个标准诱导缓解治疗没有达到完全缓解,8例为AML复发)。诱导治疗一疗程后,15例获得缓解(CR/Cri),4例部分缓解(PR),2例未缓解(NR),总有效率(ORR)为90.47%。常见不良反应为全血细胞减少及感染,未见脏器不可逆性损伤。结论:地西他滨联合低剂量化疗治疗儿童R/R-AML和MDS疗效显著,且不良反应较小,具有临床推广价值。二、异常甲基化基因DUSP16在儿童急性髓细胞白血病中的作用机制研究目的:基因甲基化修饰在儿童急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)的发生和发展中起重要作用。基因启动子CpG岛异常甲基化是抑癌基因失活的重要方式之一,双特异性蛋白磷酸酶16(dual specificity phosphatases,DUSP16)是在儿童AML大样本中成功筛选出的异常甲基化基因,且DUSP16基因在AML患儿中的作用尚未被阐明,因此,本研究将探索DUSP16基因启动子异常甲基化在儿童AML中发挥的作用及机制,为儿童AML的诊断和治疗奠定新的基础。方法:本研究采用自主设计的“三步法”策略,在儿童AML样本和对照组中筛选异常甲基化基因。使用细胞增殖、凋亡、细胞周期实验和动物实验评估DUSP16基因的功能。通过CpG岛预测软件methprimer分析DUSP16基因启动子区域的CpG岛分布情况;运用MSP(methlation specific PCR)和RT-PCR技术检测白血病细胞株和对照样本中DUSP16启动子区域的甲基化状态及其表达水平,共同分析DUSP16基因在AML细胞株中的异常甲基化情况。MSP和RT-PCR实验评估儿童AML和对照组骨髓细胞中DUSP16启动子区域的甲基化状态及其表达水平;RT-PCR检测经去甲基化药物地西他滨处理后儿童AML原代细胞中DUSP16的表达水平,并检测地西他滨处理后儿童AML原代细胞的增殖能力;对DUSP16基因在儿童AML中异常甲基化及其临床意义进行分析。聚类分析凋亡PCR芯片检测DUSP16过表达可能影响的凋亡相关基因,并进行IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析,寻找重要信号调节通路。构建GST-DUSP16融合蛋白表达载体,并运用免疫共沉淀技术检测DUSP16蛋白与组蛋白H3之间的相互作用;Western-blot检测组蛋白H3磷酸化位点的磷酸化水平。结果:“三步法”策略成功筛选出儿童AML中异常甲基化基因DUSP16。DUSP16功能实验结果显示DUSP16可以抑制MV4-11细胞的增殖;促进MV4-11细胞的凋亡;将MV4-11细胞的细胞周期阻滞于G1期;并能抑制小鼠的肿瘤负荷,延长小鼠生存期。CpG岛预测结果显示,DUSP16基因启动子区域存在2个明显的CpG岛;多株AML细胞株中DUSP16启动子呈现高甲基化状态,且DUSP16的表达量很低。儿童AML细胞中DUSP16启动子呈现高甲基化的频率明显高于对照组;定量PCR分析显示DUSP16在儿童AML中表达明显低于对照组;高度甲基化的AML样本中DUSP16表达量低于低甲基化的样本;RT-PCR检测显示6例儿童AML原代细胞经地西他滨处理后3例儿童AML原代细胞中DUSP16基因明显上调,且3例DUSP16明显上调的儿童AML原代细胞的增殖能力明显下降;分析儿童AML总生存时间显示,AML患儿DUSP16启动子高甲基化者,其生存时间明显短于非甲基化患儿组。聚类分析结果显示DUSP16上调后有34个基因明显上调,28个基因明显下调;IPA分析显示DUSP16基因对凋亡一系列相关基因的调节极有可能通过ERK、JUN(JNK)信号通路发挥作用。使用针对组蛋白H3和磷酸化组蛋白H3(针对Ser10磷酸化)的抗体均可以将DUSP16蛋白共同沉淀;Western-blot实验显示,DUSP16基因上调表达后细胞内磷酸化的组蛋白H3(Ser10磷酸化)明显降低,而对MAPKs(ERK1/2、JNK、p38)的去磷酸化作用不明显。结论:DUSP16基因是一个AML相关的肿瘤抑制基因,在儿童AML样本中呈高甲基化状态,影响AML患儿的生存时间;地西他滨能明显上调AML细胞中DUSP16基因表达和抑制DUSP16高甲基化AML细胞的增殖能力;DUSP16基因可能是通过对组蛋白H3的去磷酸化修饰作用来发挥功能。