类风湿关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫病，滑膜组织为RA的主要炎症靶点，大量炎性细胞浸润到滑膜组织，并产生多种致炎性细胞因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-17等，最终导致成纤维样滑膜细胞(FLS)类肿瘤样异常增生、迁移并获得侵袭性。其中IL-6是非常重要的致炎细胞因子，IL-6水平的增高与疾病的活动、发展以及治疗效果都密切相关，为细胞因子风暴的重要诱导分子。IL-6信号激活诱导辅助性T细胞17(Th17)细胞分化，产生IL-17，为另一个关键的促炎细胞因子，这个级联反应被称为IL-6/IL-17炎性轴，在RA的病理机制中发挥重要的作用。IL-6受体拮抗剂可有效改善RA临床表现，如关节炎症和关节破坏，但可能诱发恶性感染、肿瘤等严重不良反应，限制了其临床应用，因此寻找阻止IL-6促进IL-17等更多促炎细胞因子产生的关键分子靶点，对于自身免疫病包括RA的治疗具有重要意义。已知IL-6与IL-23、转化生长因子-β(TGF-β)共同作用，依赖蛋白酪氨酸激酶(JAK)-信号转导与活化转录因子3(STAT3)信号通路，诱导幼稚T细胞向Th17分化。近期发现，可诱导环磷腺苷早期阻抑蛋白(ICER)是Th17分化的必要分子，其由环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)信号通路产生，可促进维甲酸相关孤儿核受体(RORγt)的累积。由于cAMP是G蛋白偶联受体(GPCR)特异性介导的下游信号，在RA病程中，IL-6如何作用于GPCR信号，调节cAMP-ICER，引起Th17的分化尚无报道。有研究显示，腺苷抑制Th17细胞分化，在RA中，腺苷A3受体(A3AR)参与T细胞活化，A3AR为偶联Gαi的GPCR，抑制cAMP-PKA信号，IL-6引起的GPCR信号变化是否通过影响A3AR受体信号来发挥的尚不清楚。A3AR的活性主要受到G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)的负性调节，IL-6对GRK2有无调节作用未见报道。目前公认的GRK2抑制剂为抗抑郁药帕罗西汀，课题组前期研究发现苯磺酰芍药苷(CP-25)也具有GRK2活性抑制作用，并且可以显著抑制关节炎症，减少IL-17产生。因此本课题体外应用IL-6、IL-23、TGF-β诱导Th17细胞分化，观察IL-6对A3AR信号及其调节分子GRK2的影响；体内用IL-6抑制剂和GRK2抑制剂治疗CIA大鼠，观察GRK2抑制剂对CIA大鼠Th17分化的影响，以进一步阐明IL-6促进Th17分化的分子机制及GRK2抑制剂改善大鼠CIA的作用机理，为进一步揭示CIA的病理机制，寻找新的治疗靶点，推动CP-25这一自主知识产权新药的创制提供实验依据。
　　方法：采用磁珠分离纯化Wistar大鼠CD3+T淋巴细胞，流式细胞术观察IL-6、TGF-β、IL-23共同刺激下Th17细胞的分化情况，GRK2及A3AR在T细胞胞质、胞膜表达的变化；体外应用GRK2抑制剂帕罗西汀或A3AR激动剂，观察其对IL-6促Th17细胞分化功能的影响；并以Wistar大鼠建立CIA模型，分别给予IL-6受体(IL-6R)拮抗剂托珠单抗(TCZ)、注射用重组人II型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)或甲氨蝶呤(MTX)治疗14天，以及GRK2抑制剂帕罗西汀、CP-25或MTX治疗14天，记录大鼠整体指标变化，包括全身评分、关节炎指数、关节肿胀数和足爪肿胀度，胸腺和脾脏指数，CCK-8法检测T淋巴细胞活力，流式细胞术检测Th17细胞百分比和GRK2的分布情况，免疫荧光法检测各组大鼠脾脏冰冻切片中A3AR的表达和分布情况。
　　结果：
　　1.IL-6体外刺激对Th17细胞分化的影响。
　　TGF-β和IL-23的基础培养体系中加入IL-6，可显著促进T细胞向Th17细胞分化。
　　2.IL-6体外刺激对CD4+T细胞A3AR和GRK2胞质胞膜表达的影响。
　　IL-6/TGF-β/IL-23刺激与TGF-β/IL-23基础刺激相比，A3AR在CD4+T细胞膜上的表达降低，在胞质的表达明显升高；GRK2在CD4+T细胞膜上的表达升高，在胞质的表达降低。
　　3.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠整体指标的影响。
　　与正常大鼠相比，CIA大鼠出现全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和足爪肿胀度的显著升高，体重较正常组减轻，TCZ、rhTNFR:Fc和MTX可明显改善CIA大鼠的各项临床指标。
　　4.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠脾脏、胸腺指数的影响。
　　与正常大鼠相比，CIA大鼠的脾脏指数升高，胸腺指数降低，TCZ和MTX可显著抑制CIA大鼠脾脏指数，TCZ、rhTNFR:Fc和MTX可显著恢复CIA大鼠的胸腺指数。
　　5.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠胸腺T细胞活力的影响。
　　CCK-8检测显示，CIA组大鼠胸腺T细胞活力明显增强，TCZ、rhTNFR:Fc和MTX体内给药明显降低CIA大鼠胸腺T淋巴细胞活力。
　　6.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠脾脏Th17细胞比例的影响。
　　CIA大鼠脾脏Th17细胞比例明显升高，TCZ和MTX体内给药显著降低CIA大鼠脾脏Th17细胞比例，rhTNFR:Fc组Th17细胞比例轻度降低，但没有显著性差异。
　　7.IL-6R拮抗剂对CIA大鼠脾脏GRK2在CD4+T胞质胞膜表达的影响。
　　CIA大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜上GRK2表达明显升高，TCZ和MTX体内给药明显降低GRK2在大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜上的表达，rhTNFR:Fc给药对其没有明显影响；GRK2在各组大鼠脾脏CD4+T细胞胞质的表达水平无显著性变化。
　　8.IL-6R拮抗剂对Th17细胞中A3AR在胞质的分布情况的影响。
　　脾脏冰冻切片免疫荧光实验显示，CIA大鼠脾组织中Th17细胞的比例明显升高，TCZ、rhTNFR:Fc和MTX可降低CIA大鼠脾脏Th17细胞的比例；脾脏组织A3AR的表达水平各组间无显著性差异；CIA大鼠脾组织中IL-17与A3AR的共定位增多，TCZ、rhTNFR:Fc和MTX体内给药明显减少脾组织中IL-17与A3AR的共定位。
　　9.A3AR激动剂IB-MECA体外给药对IL-6诱导的Th17分化的影响。
　　IL-6/TGF-β/IL-23体外刺激可促进Th17细胞分化，同时给予A3AR激动剂IB-MECA可阻止Th17细胞的分化。
　　10.帕罗西汀体外给药对IL-6诱导的CD4+T细胞GRK2和A3AR胞质胞膜表达的影响。
　　与基础刺激组相比，IL-6可降低A3AR在CD4+T细胞胞膜的表达，增加其在胞质的分布；与IL-6刺激组相比，同时给予帕罗西汀可显著恢复A3AR在胞膜的表达，减少A3AR在胞质的表达；与基础刺激组相比，IL-6可升高GRK2在CD4+T细胞胞膜的表达，减少GRK2在胞质的表达；与IL-6刺激组相比，同时给予帕罗西汀可降低GRK2的胞膜分布，升高GRK2在胞质的表达。
　　11.帕罗西汀体外给药对IL-6诱导的Th17细胞分化的影响。
　　与基础刺激组相比，IL-6可显著促进Th17细胞的分化，GRK2抑制剂帕罗西汀可明显减弱IL-6/TGF-β/IL-23对Th17细胞分化的诱导作用。
　　12.GRK2抑制剂对CIA大鼠整体指标的影响。
　　与正常组相比，CIA大鼠全身评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和足爪肿胀度显著升高，体重较正常组减轻，帕罗西汀、CP-25和MTX可有效改善CIA大鼠的上述临床指标。
　　13.GRK2抑制剂对于CIA大鼠脾脏、胸腺指数的影响。
　　与正常大鼠相比，CIA大鼠的脾脏指数升高，胸腺指数降低，帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药可显著降低CIA大鼠脾脏指数，CP-25和MTX可明显恢复CIA大鼠的胸腺指数。
　　14.GRK2抑制剂对CIA大鼠脾脏Th17细胞比例的影响。
　　CIA大鼠脾脏Th17细胞比例明显升高，帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药体内给药显著降低CIA大鼠脾脏Th17细胞比例。
　　15.GRK2抑制剂对CIA大鼠脾脏GRK2在CD4+T细胞胞质胞膜表达的影响。
　　CIA大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜GRK2表达明显升高，帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药明显降低GRK2在大鼠脾脏CD4+T细胞胞膜上的表达；各组大鼠脾脏CD4+T细胞胞质的GRK2分布无显著差异。
　　16.GRK2抑制剂对Th17细胞中A3AR在胞质的分布情况的影响。
　　脾脏冰冻切片免疫荧光实验显示，CIA大鼠脾脏中Th17细胞的比例明显升高，帕罗西汀、CP-25和MTX可显著降低CIA大鼠脾脏Th17细胞的比例；各组大鼠脾脏组织A3AR的表达水平无显著变化；CIA大鼠脾脏细胞中IL-17与A3AR的共定位增强，帕罗西汀、CP-25和MTX体内给药可明显降低脾脏IL-17与A3AR的共定位。
　　结论：
　　1.IL-6升高CD4+T细胞胞膜上GRK2表达，促进A3AR内吞，抑制其信号转导，是其诱导Th17细胞分化的重要机制之一。
　　2.抑制GRK2活性可减少炎症状态下Th17细胞的分化，是CP-25改善大鼠CIA的重要作用机理。