基于半月板病理性过度肥大和钙化研究中药河蚌多糖治疗膝骨关节炎的新靶点

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目的:1.探讨半月板组织病理性退变的具体形式,并验证其与膝骨关节炎形成的相关性。2.检测25%的异常的压力刺激能否引起半月板组织损伤及病理性过度肥大和钙化相关基因和蛋白的异常表达,进而出现半月板和关节软骨的病理性退变。3.观察体外给予河蚌多糖HBP-A对半月板病理性过度肥大和钙化相关基因和蛋白表达的影响,探寻中药河蚌多糖治疗膝骨关节炎的新靶点。  方法:1.9只成年豚鼠右侧行前交叉韧带切断术(ACLT),左侧作为正常对照(control)。术后6、10周分别进行动物活体内基质蛋白酶和炎性因子的扫描。10周处死前3、5天分别注射钙黄绿素,以观察新生骨的形成。分别测量两组半月板的长度和内外侧之间的宽度,半月板病理切片进行茜素红和硝酸银染色,免疫组化MMP13、TypeX、Ihh、IL-1和ANKH、ENPP1、ALP染色。半月板和关节软骨在SO染色后分别进行评级和评分,与半月板肥大和钙化进行相关性分析。ELISA检测半月板钙化促进剂和抑制剂的含量及两者之间的比例。2.从成年牛的膝关节内提取半月板,然后切割成统一大小的组织块,给予25%的异常压力刺激,然后检测半月板组织内细胞活性,蛋白多糖的丢失,钙化促进剂和抑制剂的含量及两者之间的比例。Rt-PCR检测钙化相关基因ANKH、ENPP1和ALP在mRNA水平上的表达。WB检测MMP13和IL-1等的蛋白表达。3.体外培养人的软骨细胞进行MMP13和Runx2荧光质粒的转染,然后通过检测不同浓度的药物HBP-A对荧光质粒表达的影响,以及给予药物治疗后观察细胞活性,蛋白多糖丢失及各种肥大和钙化相关基因和蛋白的表达。  结果:1.ACLT术后半月板的长度和内外侧的宽度出现了过度肥大,明显大于正常对照组(n=3,*P<0.05)。新生骨荧光染色、茜素红和硝酸银染色同时证明半月板出现钙化的面积和强度以及病理性肥大和钙化相关蛋白MMP13、 typeⅩ、Ihh、IL-1和ANKH、ENPP1、ALP定量明显大于正常对照组(n=3,*P<0.05)。半月板病理性钙化促进剂与抑制剂也明显增加,而两者比例在ACLT组钙化促进剂明显增多。在ACLT术后小动物活体成像和SO染色证实了半月板和关节软骨出现了不同程度的损伤和病理性退变。且半月板的病理性过度肥大和钙化与关节软骨损伤呈现正相关关系(r=0.925和0.944,P<0.0001)。2.体外给予半月板异常的压力刺激,并分别培养24、48和72小时后,与阳性对照组、正常对照组、25%压力刺激1和2小时相比,25%的异常压力刺激3小时引起了半月板组织表面细胞的死亡,同时引起半月板组织蛋白多糖的丢失,半月板病理性钙化抑制剂和促进剂不同程度的增加,以及半月板病理性肥大和钙化调节蛋白和基因ANKH、ENPP1、ALP和MMP13、IL-1在mRNA及蛋白表达水平上的提高(n=3,*P<0.05)。3.体外培养人的软骨细胞C28,进行肥大和钙化相关影响因子Runx2和MMP13荧光质粒转染,基因报告检测结果证实0.6mg/ml的HBP-A能够明显抑制Runx2和MMP13荧光质粒的表达(n=3,*P<0.05),同时甲苯胺蓝和茜素红染色也证明0.6mg/ml组软骨细胞病理性肥大和钙化的减少。在体外25%异常压力刺激后,给予半月板组织0.6mg/ml的HBP-A,0.6mg/ml HBP-A组细胞死亡数量、蛋白多糖丢失含量以及钙化和肥大相关蛋白和基因ANKH、ENPP1、ALP和MMP13、IL-1在mRNA水平及蛋白表达水平均明显低于25%异常压力刺激组。  结论:1.半月板的病理性过度肥大和钙化是半月板病理性退变的主要发生形式,与关节软骨损伤呈现正相关关系,是引起膝骨关节炎的重要原因(现象)。2.异常的生物力学压力刺激能够引起半月板组织肥大和钙化相关基因和蛋白的表达,是引起半月板肥大和钙化的初始因素(机制)。3.中药河蚌多糖HBP-A能够有效抑制组织肥大和钙化相关基因和蛋白的表达,从而是治疗膝骨关节炎的潜在性药物(治疗)。
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