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目的:本课题旨在研究细粒棘球蚴 Eg95表位短肽 Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白的潜在功能及对继发性细粒棘球蚴感染小鼠的免疫保护作用及其机制,希望能为包虫病的防治寻找到更有效的保护性抗原,为今后开展棘球蚴病的特异性疫苗免疫预防和免疫干预研究奠定基础,对开拓包虫病的防治新方法具有重要的理论价值和潜在的应用前景。 方法:本课题组前期已经通过生物信息学技术分析并获得Eg95蛋白的T-B细胞联合表位信息,应用噬菌体展示系统对预测得到的T-B联合表位进行鉴定和筛选,成功构建出Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3原核表达载体,得到并纯化Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白。 动物实验第一部分:将小鼠随机分为4组,前三组分别将Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白与弗氏佐剂混匀免疫BALB/c小鼠,第4组为生理盐水对照组,通过ELISA检测0周、2周、4周、6周、8周、10周各组小鼠体内IgG和IgE水平,检测0周、第10周脾淋巴细胞上清细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平,MTT法检测第10周脾淋巴细胞增殖;动物实验第二部分:将小鼠随机分为4组,分别将Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白与弗氏佐剂混匀免疫BALB/c小鼠,第4组为生理盐水对照组,在第8周用细粒棘球蚴原头蚴腹腔攻击感染,并通过 ELISA检测未免疫、免疫后、免疫并攻击感染后(0周、8周、10周、32周)各组小鼠体内IgG和IgE水平及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平,CCK法检测第32周脾淋巴细胞增殖。结果:成功表达和纯化了Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白。动物实验第一部分:细粒棘球蚴Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白免疫小鼠后,随着免疫次数的增加和时间的延长,从第4周开始小鼠体内IgG和IgE水平均逐渐升高,IgE在第8周达到高峰,然后呈下降趋势,但与0周相比仍有统计学意义。Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组脾淋巴细胞被Eg95抗原刺激后上清细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平在第10周明显比0周高,生理盐水对照组脾淋巴细胞在Eg95抗原刺激下细胞因子均则无明显变化。Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组和生理盐水对照组的小鼠脾淋巴细胞在体外均能被 ConA刺激诱导发生增殖,且Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组也能被Eg95抗原刺激诱导发生增殖,且第10周时,三组实验组均具有统计学意义。 动物实验第二部分:Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组的IgG和IgE以及IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平在第8周、第10周、第32周与第0周比较均增高,具有统计学意义。Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组的IL-2、TNF-α和IFN-γ均在第10W达高峰,在第32W逐渐下降,但仍高于其组第0W水平,具有统计学意义。生理盐水对照组IL-2、TNF-α和IFN-γ水平在第10W达高峰,在第32W逐渐下降,与0W相比差异均有统计学意义。Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组和生理盐水对照组的IL-4和IL-10均呈增长趋势,在第8周、第10周、32周均有统计学意义。经Eg95抗原刺激后,Eg95-1组、Eg95-2组、Eg95-3组及生理盐水对照组脾淋巴细胞均发生显著增殖,与无刺激物相比具有统计学意义。 结论:细粒棘球蚴Eg95表位短肽Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白免疫小鼠后可诱导以IgG为主的体液免疫应答。细粒棘球蚴Eg95表位短肽Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白免疫小鼠后能诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答。细粒棘球蚴Eg95表位短肽Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白能诱导继发性细粒棘球蚴感染小鼠产生较强的保护力,可通过体液免疫应答和细胞免疫应答发挥免疫保护作用。细粒棘球蚴Eg95表位短肽Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPIII融合蛋白可以作为终末宿主犬用候选疫苗分子,作为后期将有效地抗原表位连接起来,开发MAP,为研究出预防棘球蚴病更强、更有效的疫苗奠定基础。