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【目的】
本研究以去卵巢骨质疏松症大鼠和去卵巢骨质疏松大鼠成骨细胞(OB)为研究对象，从动物和细胞两个层面评价黄芪三仙汤对绝经后骨质疏松症(PMOP)的防治作用，进而探究黄芪三仙汤对PI3K/Akt信号通路的影响及其调控机制。
【方法】
体内实验：
1.将三月龄雌性SD大鼠，分为正常(Normal)组、假手术(Sham)组、模型(OVX )组、阳性药雷洛昔芬(Ral-S )组、高/中/低剂量黄芪三仙汤(HQSXD(H)/HQSXD(M)/HQSXD(L))组，通过去势手术构建去卵巢骨质疏松大鼠模型，连续给药12周。
2.用双能X线骨密度仪检测大鼠股骨的骨密度(BMD)。
3.用ELISA测定大鼠血清中E2、IL-1、IL-6、TNF-α、PHB1的水平。
4.制备股骨石蜡切片，用HE染色后检测骨组织形态，用TUNEL染色检测骨细胞的凋亡。
5.用WesternBlot检测大鼠股骨中pAkt1/Akt1、pAkt2/Akt2、PHB1、ERα的蛋白表达量。
体外实验：
1.用酶消化法从OVX组大鼠颅骨中提取去卵巢骨质疏松大鼠OB。
2.将三月龄雌性SD大鼠，分为正常组、阳性药雷洛昔芬组、黄芪三仙汤组，连续给药一周后提取含药血清(Normal-S、Ral-S和HQSXD-S)。
3.用CCK8法检测不同浓度含药血清、不同干预时间下去卵巢骨质疏松大鼠OB的增殖情况。
4.无血清培养基饥饿诱导去卵巢骨质疏松大鼠OB凋亡后，用流式细胞术检测各组含药血清干预后OB的凋亡情况。
5.用碱性磷酸酶(ALP)染色及活性定量检测各组含药血清干预后去卵巢骨质疏松大鼠OB的分化情况。
6.用茜素红(ARS)染色矿化结节及钙离子浓度的测定来检测各组含药血清干预后去卵巢骨质疏松大鼠OB的矿化情况。
7.各组含或不含Ly294002的含药血清干预后，用WesternBlot检测去卵巢骨质疏松大鼠OB中pAkt1/Akt1、pAkt2/Akt2、PHB1、ERα、Bcl-xl、Caspase3、Runx2、Osx、OPN的蛋白表达量。
【结果】
体内实验：
1.给药12周后，与Normal组、Sham组相比，OVX组体重明显增加；与OVX组相比，Ral组的体重明显降低；各HQSXD治疗组体重与OVX组相比无明显差异。
2.OVX组大鼠股骨各段的BMD较Normal组、Sham组均显著降低。与OVX组相比，Ral组股骨各段的BMD均显著增加；HQSXD(H)组和HQSXD(M)组股骨远端、近端及HQSXD(L)组股骨远端的BMD均明显增加。
3.Normal组、Sham组的骨小梁排列紧密，结构完整；OVX组骨小梁断裂、缺失严重。与OVX组相比，Ral组的骨小梁断裂、缺失情况得到了明显的改善，骨小梁排列紧密，结构相对完整；黄芪三仙汤各治疗组的骨小梁断裂、缺失情况也均有所改善，且改善效果呈剂量依赖性。
4.与Normal组、Sham组相比，OVX组的E2水平明显降低，TNF-α、IL-1、IL-6水平均明显升高。与OVX组相比，Ral组、HQSXD(H)组和HQSXD(M)组的E2水平均显著增加，TNF-α、IL-1、IL-6的水平均显著降低；HQSXD(L)组的TNF-α也明显降低。
5.在股骨松质骨和皮质骨中，Normal组和Sham组的骨细胞凋亡数量极少；OVX组中明显可见大量棕色凋亡骨细胞。与OVX组相比，Ral组的凋亡骨细胞数量明显减少；黄芪三仙汤各治疗组中的凋亡骨细胞数量也有一定减少，HQSXD(H)组的凋亡骨细胞数量明显减少，HQSXD(M)组中可见部分棕色凋亡骨细胞，HQSXD(L)组仍可见大量凋亡骨细胞。
6.与Normal组和Sham组相比，OVX组大鼠股骨中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的蛋白表达量显著降低，血清和股骨中PHB1的水平均显著升高；与OVX组对比，Ral组、HQSXD(H)组和HQSXD(M)组股骨中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的蛋白表达量均显著增加，血清和股骨中PHB1的水平均显著降低。
体外实验：
1.与2.5%含药血清相比，5%、10%、15%、20%含药血清均能促进去卵巢骨质疏松大鼠OB增殖。20%浓度的各组含药血清培养液分别干预48h、72h后，与Normal-S组相比，Ral-S和HQSXD-S组均能显著促进PMOPOB增殖。
2.与Normal-S组对比，Ral-S组中去卵巢骨质疏松大鼠OB的凋亡数量明显减少，差异有统计学意义；而HQSXD-S组中去卵巢骨质疏松大鼠OB的凋亡数量有一定减少，但差异无统计学意义。
3.Ral-S组和HQSXD-S组的ALP染色、ALP活性、ARS染色及钙离子浓度均显著多于Normal-S组。
4.与Normal-S组相比，Ral-S组和HQSXD-S组去卵巢骨质疏松大鼠OB中的p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的蛋白表达量均显著升高，PHB1的表达量显著降低；而与HQSXD-S组相比，HQSXD-S+Ly294002组的p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的表达量均显著降低，PHB1的表达量则显著升高。
5.Ral-S组和HQSXD-S组中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达量显著高于Normal-S组；HQSXD-S组中促凋亡蛋白Caspaes3的表达水平明显低于Normal-S组。而与HQSXD-S组相比，HQSXD-S+Ly294002组中Bcl-xl的表达水平降低，Caspaes3的表达水平升高。
6.与Normal-S组相比，Ral-S组和HQSXD-S组去卵巢骨质疏松大鼠OB中成骨分化相关蛋白Runx2、Osx和OPN的表达量均显著升高；而HQSXD-S+Ly294002组的Runx2、Osx和OPN的表达量较HQSXD-S组则显著降低。
【结论】
1.黄芪三仙汤可提高去卵巢大鼠的BMD，改善骨小梁微结构，抑制血清炎症因子及股骨骨细胞的凋亡，从而发挥防治PMOP的作用。
2.黄芪三仙汤对PMOP的防治作用可能与激活PI3K/Akt信号通路，抑制PHB1的表达密切相关。
3.黄芪三仙汤可促进去卵巢骨质疏松大鼠OB的增殖、分化与矿化。
4.黄芪三仙汤可能通过激活PI3K/Akt信号通路，上调去卵巢骨质疏松大鼠OB中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达，下调促凋亡蛋白Caspase3的表达。
5.黄芪三仙汤可能通过激活PI3K/Akt信号通路，上调去卵巢骨质疏松大鼠OB中成骨相关蛋白Runx2、Osx和OPN的表达，发挥促进去卵巢骨质疏松大鼠OB成骨分化的作用。
本研究以去卵巢骨质疏松症大鼠和去卵巢骨质疏松大鼠成骨细胞(OB)为研究对象，从动物和细胞两个层面评价黄芪三仙汤对绝经后骨质疏松症(PMOP)的防治作用，进而探究黄芪三仙汤对PI3K/Akt信号通路的影响及其调控机制。
【方法】
体内实验：
1.将三月龄雌性SD大鼠，分为正常(Normal)组、假手术(Sham)组、模型(OVX )组、阳性药雷洛昔芬(Ral-S )组、高/中/低剂量黄芪三仙汤(HQSXD(H)/HQSXD(M)/HQSXD(L))组，通过去势手术构建去卵巢骨质疏松大鼠模型，连续给药12周。
2.用双能X线骨密度仪检测大鼠股骨的骨密度(BMD)。
3.用ELISA测定大鼠血清中E2、IL-1、IL-6、TNF-α、PHB1的水平。
4.制备股骨石蜡切片，用HE染色后检测骨组织形态，用TUNEL染色检测骨细胞的凋亡。
5.用WesternBlot检测大鼠股骨中pAkt1/Akt1、pAkt2/Akt2、PHB1、ERα的蛋白表达量。
体外实验：
1.用酶消化法从OVX组大鼠颅骨中提取去卵巢骨质疏松大鼠OB。
2.将三月龄雌性SD大鼠，分为正常组、阳性药雷洛昔芬组、黄芪三仙汤组，连续给药一周后提取含药血清(Normal-S、Ral-S和HQSXD-S)。
3.用CCK8法检测不同浓度含药血清、不同干预时间下去卵巢骨质疏松大鼠OB的增殖情况。
4.无血清培养基饥饿诱导去卵巢骨质疏松大鼠OB凋亡后，用流式细胞术检测各组含药血清干预后OB的凋亡情况。
5.用碱性磷酸酶(ALP)染色及活性定量检测各组含药血清干预后去卵巢骨质疏松大鼠OB的分化情况。
6.用茜素红(ARS)染色矿化结节及钙离子浓度的测定来检测各组含药血清干预后去卵巢骨质疏松大鼠OB的矿化情况。
7.各组含或不含Ly294002的含药血清干预后，用WesternBlot检测去卵巢骨质疏松大鼠OB中pAkt1/Akt1、pAkt2/Akt2、PHB1、ERα、Bcl-xl、Caspase3、Runx2、Osx、OPN的蛋白表达量。
【结果】
体内实验：
1.给药12周后，与Normal组、Sham组相比，OVX组体重明显增加；与OVX组相比，Ral组的体重明显降低；各HQSXD治疗组体重与OVX组相比无明显差异。
2.OVX组大鼠股骨各段的BMD较Normal组、Sham组均显著降低。与OVX组相比，Ral组股骨各段的BMD均显著增加；HQSXD(H)组和HQSXD(M)组股骨远端、近端及HQSXD(L)组股骨远端的BMD均明显增加。
3.Normal组、Sham组的骨小梁排列紧密，结构完整；OVX组骨小梁断裂、缺失严重。与OVX组相比，Ral组的骨小梁断裂、缺失情况得到了明显的改善，骨小梁排列紧密，结构相对完整；黄芪三仙汤各治疗组的骨小梁断裂、缺失情况也均有所改善，且改善效果呈剂量依赖性。
4.与Normal组、Sham组相比，OVX组的E2水平明显降低，TNF-α、IL-1、IL-6水平均明显升高。与OVX组相比，Ral组、HQSXD(H)组和HQSXD(M)组的E2水平均显著增加，TNF-α、IL-1、IL-6的水平均显著降低；HQSXD(L)组的TNF-α也明显降低。
5.在股骨松质骨和皮质骨中，Normal组和Sham组的骨细胞凋亡数量极少；OVX组中明显可见大量棕色凋亡骨细胞。与OVX组相比，Ral组的凋亡骨细胞数量明显减少；黄芪三仙汤各治疗组中的凋亡骨细胞数量也有一定减少，HQSXD(H)组的凋亡骨细胞数量明显减少，HQSXD(M)组中可见部分棕色凋亡骨细胞，HQSXD(L)组仍可见大量凋亡骨细胞。
6.与Normal组和Sham组相比，OVX组大鼠股骨中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的蛋白表达量显著降低，血清和股骨中PHB1的水平均显著升高；与OVX组对比，Ral组、HQSXD(H)组和HQSXD(M)组股骨中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的蛋白表达量均显著增加，血清和股骨中PHB1的水平均显著降低。
体外实验：
1.与2.5%含药血清相比，5%、10%、15%、20%含药血清均能促进去卵巢骨质疏松大鼠OB增殖。20%浓度的各组含药血清培养液分别干预48h、72h后，与Normal-S组相比，Ral-S和HQSXD-S组均能显著促进PMOPOB增殖。
2.与Normal-S组对比，Ral-S组中去卵巢骨质疏松大鼠OB的凋亡数量明显减少，差异有统计学意义；而HQSXD-S组中去卵巢骨质疏松大鼠OB的凋亡数量有一定减少，但差异无统计学意义。
3.Ral-S组和HQSXD-S组的ALP染色、ALP活性、ARS染色及钙离子浓度均显著多于Normal-S组。
4.与Normal-S组相比，Ral-S组和HQSXD-S组去卵巢骨质疏松大鼠OB中的p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的蛋白表达量均显著升高，PHB1的表达量显著降低；而与HQSXD-S组相比，HQSXD-S+Ly294002组的p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα的表达量均显著降低，PHB1的表达量则显著升高。
5.Ral-S组和HQSXD-S组中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达量显著高于Normal-S组；HQSXD-S组中促凋亡蛋白Caspaes3的表达水平明显低于Normal-S组。而与HQSXD-S组相比，HQSXD-S+Ly294002组中Bcl-xl的表达水平降低，Caspaes3的表达水平升高。
6.与Normal-S组相比，Ral-S组和HQSXD-S组去卵巢骨质疏松大鼠OB中成骨分化相关蛋白Runx2、Osx和OPN的表达量均显著升高；而HQSXD-S+Ly294002组的Runx2、Osx和OPN的表达量较HQSXD-S组则显著降低。
【结论】
1.黄芪三仙汤可提高去卵巢大鼠的BMD，改善骨小梁微结构，抑制血清炎症因子及股骨骨细胞的凋亡，从而发挥防治PMOP的作用。
2.黄芪三仙汤对PMOP的防治作用可能与激活PI3K/Akt信号通路，抑制PHB1的表达密切相关。
3.黄芪三仙汤可促进去卵巢骨质疏松大鼠OB的增殖、分化与矿化。
4.黄芪三仙汤可能通过激活PI3K/Akt信号通路，上调去卵巢骨质疏松大鼠OB中抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达，下调促凋亡蛋白Caspase3的表达。
5.黄芪三仙汤可能通过激活PI3K/Akt信号通路，上调去卵巢骨质疏松大鼠OB中成骨相关蛋白Runx2、Osx和OPN的表达，发挥促进去卵巢骨质疏松大鼠OB成骨分化的作用。